アニオン性ナノプラスチックへの曝露は内皮漏出を誘発する

Aug 13, 2023

Nature Communications volume 13、記事番号: 4757 (2022) この記事を引用

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地球規模のプラスチック生産は現代社会の発展に貢献してきたが、埋め立て地や海洋、その他あらゆる場所でのプラスチックの蓄積の増加は、環境の持続可能性、気候、そして潜在的には人間の健康に対する大きなストレス要因となっている。 人間や自然の機械的および化学的力により、最終的にはプラスチックが分解またはリサイクルされる可能性がありますが、プラスチック、特にナノプラスチックの生物学的指紋についての理解は依然として不十分です。 今回我々は、共焦点蛍光顕微鏡、シグナル伝達経路、分子動力学シミュレーションによって明らかになった、アニオン性ポリスチレンとポリ（メタクリル酸メチル）のナノプラスチック形態に関連した現象について報告する。この現象では、それらの導入により用量依存的に血管内皮カドヘリン結合が破壊されることが明らかになった。 、動物モデルシステムを使用した ex vivo および in vivo アッセイも可能です。 まとめると、我々の結果は、ナノプラスチックによって誘導される血管透過性が本質的に主に生物物理学的生化学的であり、活性酸素種の生成、オートファジー、アポトーシスなどの細胞毒性事象とは相関しないことを示唆しました。 この未発見の細胞傍輸送経路は、ナノプラスチックの挙動と生物学的影響を研究するための広大な道を切り開き、持続可能なプラスチック産業と環境修復に向けてイノベーションを導くための重要な洞察を提供する可能性がある。

マイクロプラスチックおよびナノプラスチックは、産業や研究機関から、または衣料品、シャンプー、プラスチック製ティーバッグなどの商品の副産物として、環境に排出されるプラスチックの物理的、化学的、生物学的分解の派生物です1。 世界のプラスチック生産量は過去 1 世紀にわたって着実に増加し、2018 年だけで 3 億 5,900 万トンに達し 2、これらの人工材料、特にマイクロおよびナノプラスチックの形態における生物学的悪影響を理解し、軽減することが重要になっています。現代の生活様式を維持しながら、人間の健康と環境の持続可能性を実現します。

微量のプラスチックは、空気、水、土壌中に蔓延していることから、吸入、摂取、経皮暴露を介して動物や人間の臓器で検出されています4,5。 ナノプラスチックは、体積あたりの表面積や毒性プロファイルにおいて、より広範囲に研究されているマイクロサイズの対応物とは異なり、動物の成長、生殖、代謝を損ない6、7、8、9、サイトカイン分泌、アポトーシス、小胞体ストレスを上昇させることによって免疫系を損なう可能性があります。 、酸化ストレス10、11、12、13。

最近、所定のサイズ範囲（つまり、<100 nm）の TiO2、SiO2、金、ナノダイヤモンドなどのアニオン性無機ナノ粒子が、血管内皮カドヘリン（VE-カドヘリン）結合を破壊して、一過性のミクロン単位の結合を形成する可能性があることが報告されました。内皮単層にあるサイズの物理的開口部14、15。 ナノ材料誘起内皮漏出性 (NanoEL) と呼ばれるこの現象は、ナノ毒性学だけでなくナノ医療にも重大な影響を及ぼします。ナノ構造は、血液脳関門を通過する血管循環を介して薬物を送達したり、組織の異常を検出したりするように設計されています 16 ( BBB）時々。 この研究では、ナノプラスチックによって引き起こされるヒト臍帯静脈内皮細胞 (HUVEC) における内皮漏洩という、ナノプラスチックへの曝露に関連する生物学的現象について報告します。 この発見は、(1) ナノプラスチックが NanoEL16 を誘発することが知られていない高分子材料であること、(2) ナノプラスチックの密度、つまりポリスチレンの場合は約 1.05 g/m3、ポリ(メチルメタクリレート) の場合は約 1.18 g/m3 であるという点で驚くべきものです。 (PMMA)、NanoEL 対応無機ナノ粒子について決定された閾値 1.72 g/m3 よりもかなり低い17。 具体的には、分子動力学シミュレーションを使用して、ポリスチレンおよびPMMAナノプラスチックによるVE-カドヘリン二量体破壊の分子機構を検討し、ウサギおよびブタの静脈でのex vivoおよびナノプラスチックに曝露されたマウスでのin vivoでの内皮漏出性をさらに文書化した。 この研究は、血管透過性がナノプラスチックの傍細胞輸送のメカニズムとして関与していることを示唆し、生態圏に密集するプラスチックの生物学的挙動と運命を理解するという我々の探求における重要な知識の空白を埋めた。

ポリスチレン (PS) ナノプラスチックの形態と流体力学的直径は、透過型電子顕微鏡 (TEM) と動的光散乱 (DLS) によって特性評価されました。 図1a、b、および補足図1に示すように、PSビーズは単分散であり、TEMで示されるように、水中では21.2±3.5nm、内皮細胞培地（ECM）中では26.2±4.6nmの平均サイズを想定しました。 比較すると、PS ナノプラスチックは、ある程度の凝集により、DLS で測定したとき、H2O 中で 62 ± 5.0 nm、ECM 中で 72 ± 2.0 nm の流体力学的サイズを示しました。 したがって、ナノプラスチックのゼータ電位は、H2O 中での -35.4 ± 1.9 mV から ECM 中での -7.5 ± 0.5 mV に変化しました (補足表 1)。 さらに、X線光電子分光法（XPS）分析により、ナノプラスチック上にカルボキシル基が存在することが示されました（図1c）。 ナノプラスチックの毒性は、in vitro Cell Counting Kit-8 (CCK 8)、活性酸素種 (ROS)、および細胞死亡率アッセイによってさらに定量化されました。HUVEC は、経時的にさまざまな濃度のナノプラスチックに曝露されました (図 1d、図 1d)。 eおよび補足図2）。 DNAの完全性および/または膜が損なわれたHUVECは、22時間の処理によるヨウ化プロピジウム（PI）染色によって示され（図1dおよび補足図2a）、すべてのナノプラスチック濃度で最大10時間のインキュベーションで明らかな細胞死は発生しませんでした。適用済み。 0.5 mg/mL の PS ナノプラスチックでは 22 時間後に細胞の収縮と変形が発生しましたが、0.05 ～ 0.25 mg/mL の PS 濃度では細胞生存率や膜損傷に有意な変化は観察されませんでした。 治療期間が短い場合、細胞生存率は、曝露後1時間以内の0.05および0.5 mg/mLのPSナノプラスチックによる影響を受けませんでしたが（図1e）、ROS産生はナノプラスチックの濃度および時間と正の相関がありました。 具体的には、ROS は、低ナノプラスチック濃度 (0.05 および 0.1 mg/mL) で 1 時間にわたって観察されました (補足図 2b、c)。 HUVEC における PS ナノプラスチックの内部移行は、インキュベーション時間と用量の増加により強化されました (図 1f および補足図 3)。 さらに、PS ナノプラスチックがどのように細胞死を誘発するかを研究しました。 オートファジーは、細胞死と生存の両方に関与する自己消化プロセス 18 です 19。 微小管関連タンパク質軽鎖 3 (LC3) の脂質化型である LC3-II は、オートファゴソーム マーカーであることが示されており、LC3-II の形成または代謝回転率はオートファジー活性の指標として使用されます 20。 我々は、0.05 mg/mL PS ナノプラスチックは、1 時間および 3 時間では HUVEC における LC3-II の変換を増加させなかったが、6 時間では LC3-II の発現レベルを有意に上方制御したことを発見した。 さらに、LC3-IIの豊富な発現は、0.5 mg/mL PSナノプラスチックの存在下でわずか1時間で検出できました（図1g）。 さらに、PSナノプラスチックは、6時間でHUVECのPI3K / AKT経路を阻害することにより、オートファジーとアポトーシスを誘導しました（補足図4および5）。 具体的には、ウエスタンブロットにより、オートファジー関連タンパク質のBeclin1、p62、Atg5とプロアポトーシスタンパク質BaxがHUVECにおいて用量依存的に大幅に増加する一方、抗アポトーシスタンパク質Bcl-2が大幅に減少することが示された。 遺伝子発現とタンパク質発現の結果はよく一致していました（補足図4および5）。 HUVECを0.05または0.5 mg / mLのPSナノプラスチックに6時間曝露すると、核の萎縮とアポトーシス体の形成が観察されました（補足図6）。

a、b Milli-Q 水中のポリスチレン (PS) ナノプラスチックの TEM イメージングとそれらの対応するサイズ分布 (n = 341 個のナノ粒子を調べた)。 スケールバー: 50 nm。 c PS ナノプラスチックの官能基は、X 線光電子分光法 (XPS) 分析によって決定されました。 284.83 eV の主なピークは C-C 結合に起因し、286.34 eV および 289.28 eV の他のピークはそれぞれ C-O および O=C-O 結合に起因すると考えられます。 d 異なる濃度のPSナノプラスチックに22時間曝露したときのHUVECの毒性。 PI で染色された死細胞は赤色蛍光チャネルで明らかになりました (n = 3 生物学的複製)。 スケールバー: 200 μm。 e 0.05および0.5 mg/mLのPSナノプラスチックを使用した細胞生存率を、さまざまな時間（1、3、および6時間）でCCK8アッセイによって測定しました。 H2O2 (200 μM) をポジティブコントロールとして使用しました。 統計分析は、一元配置 ANOVA とそれに続く Tukey の多重比較検定を通じて実行されました。 各グループのコントロールと比較した P 値をパネルに挿入しました。 f 1、3、および6時間でのさまざまな濃度のPSナノプラスチックについての細胞会合の評価。 ナノプラスチックからの緑色蛍光はフローサイトメトリーによって測定されました。 データは平均値 ± SD (n = 3) として表されます。 統計分析は、二元配置 ANOVA とそれに続く Tukey の多重比較検定を通じて実行されました。 導出された P 値がパネルに挿入されました。 g 微小管関連タンパク質軽鎖 3-II/I (LC3-II/I) 発現レベルのウェスタンブロットおよび半定量分析。 HUVEC を PS ナノプラスチック (0.05 および 0.5 mg/mL) に異なる時間 (1、3、および 6 時間) 曝露しました。 6時間処理したラパマイシン(1μM)を陽性対照として使用した。 タンパク質レベルは、β-アクチンとの比較によって標準化されました。 データは平均値 ± SD として表されます。 生物学的に独立したサンプルを使用しました (n = 3)。 統計分析は、二元配置 ANOVA とそれに続く Tukey の多重比較検定を通じて実行されました。 導出された P 値がパネルに挿入されました。 ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。

アニオン性無機ナノ粒子は、内皮細胞間の接着結合に移動して破壊し、NanoEL21 を誘導します。 興味深いことに、ポリマー PS ナノプラスチックの存在下で HUVEC 内の NanoEL が観察されました。 私たちは、ナノプラスチックが接着結合を破壊し、さらに内皮漏出を引き起こす可能性があると仮定しました（図2a）。 内皮漏出性の発生を確認するために、さまざまな濃度の PS ナノプラスチックに曝露した無傷の HUVEC 単層を用いて、蛍光プローブであるフルオレセイン イソチオシアネート結合デキストラン (FITC-デキストラン) を使用してトランスウェル アッセイを実行しました (図 2b)。 曝露後 1 時間以内に細胞を 0.5 mg/mL のナノプラスチックで処理すると、顕著な漏れが観察されました。 処理が 6 時間に増加すると、ナノプラスチックのすべての濃度で内皮漏出の出現が観察されました。 次に、免疫蛍光染色を使用して内皮バリアの接着結合の破壊を視覚化しました。ここでは、0.05および0.5 mg/mLの2つの代表的な濃度のPSナノプラスチックをHUVECに適用し、0.5 mMのEDTAをポジティブコントロールとして使用しました（図2c、補足図7および8）。 0.05 mg/mL および 0.5 mg/mL のナノプラスチックでは、6 時間で豊富なギャップが観察されました。 HUVEC における形態学的変化と VE-カドヘリンの完全性の破壊は、対照と比較して 3 時間および 6 時間で顕著でした。 内皮漏出の程度は、ImageJ を使用したギャップ領域分析によって決定されました（図 2d および補足図 7）21。 導き出されたギャップ領域のパーセンテージは、内皮漏出性が 0.05 および 0.5 mg/mL の PS ナノプラスチックで時間の経過とともにより顕著であるというトランスウェル アッセイのデータを裏付けました。 6 時間における内皮漏出性の程度は、1 時間および 3 時間のインキュベーションと比較して顕著な増加を示しました。 同時に、アクチンフィラメントの蛍光強度の変化は、0.05 mg/mL のナノプラスチックの 3 時間および 6 時間の曝露およびナノプラスチックの 1、3、6 時間の曝露で、内皮漏出現象と関連して細胞骨格アクチンネットワークの再構成を示しました。それぞれ0.5 mg/mLで（図2e）。 さらに、VE-カドヘリンタンパク質プルダウンアッセイを実施して、PSナノプラスチックが接着結合に直接結合して破壊できるかどうかを調査しました。 異なる濃度の PS ナノプラスチックに異なる時間曝露した後、細胞全体が溶解され、培地中の PS ナノプラスチックとその関連タンパク質が同時に遠心分離によって引き下げられました。 図2fおよび補足図9に示すように、接着結合の同種親和性VE-カドヘリンはPSナノプラスチックによって用量依存的に引き下げられ、PSに結合したVE-カドヘリンの上昇が0.5 mg /一方、PS ナノプラスチックによってプルダウンされた VE-カドヘリンの量は、曝露時間の影響を受けませんでした。 さらに、0.05 および 0.5 mg/mL の PS ナノプラスチックを未処理の細胞溶解物 (溶解後、P) に添加しましたが、検出可能な VE カドヘリンは減少しませんでした。 特定の結果を解釈すると、PS ナノプラスチックは溶解バッファー条件ではなく接着結合部内で VE カドヘリンに結合していることが示され、PS ナノプラスチックが VE カドヘリンに結合するには無傷の接着結合が必要であることが示唆されました。 一方、PS ナノプラスチックを使用しない細胞溶解後のプロテイン A/G 磁気ビーズ (A) の存在下では、プルダウン VE カドヘリンは存在しませんでした。 全細胞溶解物は、さまざまなグループにわたって同様の VE-カドヘリンの発現を示し、PS ナノプラスチックが細胞の VE-カドヘリン発現に転写または翻訳後に影響を及ぼさないことを示しました。

a 接着結合とポリスチレン (PS) ナノプラスチック間の相互作用を示します。 HUVEC 単層の完全性は、VE-カドヘリンとの相互作用により、PS ナノプラスチックによって破壊されました。 b トランスウェルアッセイでは、内皮細胞バリアの漏れやすさが用量依存性と時間依存性であることが示されました。 データは平均値 ± SD (n = 3 の生物学的に独立したサンプル) として表されます。 統計分析は、一元配置分散分析とそれに続く Tukey の多重比較検定を通じて実行されました。 各グループの対照と比較して導出された P 値をパネルに挿入しました。 c 共焦点蛍光顕微鏡では、異なる濃度の PS ナノプラスチック (0.05 および 0.5 mg/mL) の存在下で、1、3、および 6 時間の曝露時に内皮漏出性が観察されました (n = 3 生物学的複製)。 VE-カドヘリンは赤色に染色されました。 白い矢印は、HUVEC 間の PS 誘発ギャップを示します。 スケールバー: 20 μm。 d ギャップ領域の半定量分析は、パネルcの画像に従ってImageJソフトウェアによって実行されました。 データは平均値 ± SD (n = 3 の生物学的に独立した実験) として表されます。 統計分析は、二元配置 ANOVA とそれに続く Tukey の多重比較検定を通じて実行されました。 対照と比較して得られた P 値をパネルに挿入しました。 e アクチン強度は、補足図7の画像に対応するImageJソフトウェアによって分析されました。アクチンフィラメントはファロイジン-iFluor 488によって染色されました。データは平均±SDとして表されます（n = 3の生物学的に独立した実験）。 統計分析は、二元配置 ANOVA とそれに続く Tukey の多重比較検定を通じて実行されました。 対照と比較して得られた P 値をパネルに挿入しました。 f PSは、用量依存的に接着結合同型親和性VEカドヘリン（VEC）に直接結合した。 溶解後 (P)、未処理対照に 0.05 および 0.5 mg/mL の PS を添加しても、検出可能な VE-カドヘリンは減少しませんでした。 プロテイン A/G 磁気ビーズ (A) を添加して、PS を添加しないと検出可能な VE-カドヘリンが沈殿しないことを示しました (n = 3 の生物学的に独立した実験)。 ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。 (パネル a の一部のアート要素は、smart.servier.com からのものです)。

上記のカルボキシル化 PS ナノプラスチックとは別に、我々は、異なる電荷と化学物質のナノプラスチックの NanoEL 能力を調査するために、他の 2 種類のナノプラスチック、すなわちアミノ化ポリスチレン (NH2-PS) とポリ(メタクリル酸メチル) (PMMA) も使用しました。構成。

同様に、NH2-PS および PMMA ナノプラスチックは両方とも、TEM、DLS、および XPS によって特性評価されました。 特に、TEM は、NH2-PS と PMMA の平均サイズがそれぞれ 19.7 ± 3.8 nm と 54.7 ± 6.1 nm であることを明らかにしました (図 3a、補足図 10 および 11)。一方、DLS 測定は、NH2-PS と PMMA の流体力学的サイズの 2 つのピークを示しました。 H2O 中の NH2-PS ナノプラスチックの場合は 31 ± 0.6 nm および 3984 ± 253.4 nm、PMMA ナノプラスチックの場合は 89 ± 1.3 nm (補足表 1)。 さらに、ゼータ電位測定により、NH2-PS ナノプラスチックの場合は 31.0 ± 1.3 mV の正の表面電荷、PMMA の場合は -24.8 ± 0.7 mV の負の表面電荷が明らかになりました (補足表 1)。 ナノプラスチックのサイズとゼータ電位も DLS によって ECM でテストされましたが、大きな変化は見られませんでした。 両方のナノプラスチックの表面特性をXPSでさらに分析したところ、予想どおりNH2-PSナノプラスチック上にアミドゲンが存在し、PMMAナノプラスチック上にカルボキシルが存在することが明らかになりました（図3b）。

H2O中のNH2-PSおよびPMMAナノプラスチックのTEMイメージング（n = 3の独立したサンプル）。 b NH2-PS および PMMA ナノプラスチックの官能基は XPS 分析によって決定されました。 402.06 eV および 400.02 eV の NH2-PS の主なピークは、それぞれ C-N 結合および NH-H 結合を示しています。 284.74 eV での PMMA の主なピークは C-C または C=C 結合から生じ、286.33 eV と 288.57 eV のピークはそれぞれ C-O 結合と O=C-OH 結合に起因すると考えられます。 c、d さまざまな時間（1、3、および6時間）でCCK8アッセイによって測定された、0.05および0.5 mg/mLのNH2-PSおよびPMMAナノプラスチックの細胞生存率。 H2O2 (200 μM) をポジティブコントロールとして使用しました。 データは平均値 ± SD (n = 3 の生物学的に独立した実験) として表されます。 統計分析は、一元配置分散分析とそれに続く Tukey の多重比較検定を通じて実行されました。 対照と比較して得られた P 値をパネルに挿入しました。 e、f トランスウェルアッセイは、正に帯電したNH2-PSナノプラスチックは内皮漏出性を誘発する能力がない一方、負に帯電したPMMAナノプラスチックは内皮細胞バリアの漏出を引き起こしたことを示しました。 データは平均値 ± SD (n = 3 の生物学的に独立した実験) として表されます。 統計分析は、二元配置 ANOVA とそれに続く Tukey の多重比較検定を通じて実行されました。 対照と比較して得られた P 値をパネルに挿入しました。 g 共焦点蛍光顕微鏡により、PMMA ナノプラスチック (0.05 および 0.5 mg/mL) の存在下で 1、3、および 6 時間の処理で内皮漏出性が明らかになりました (n = 3 の生物学的に独立した実験)。 白い矢印は、HUVEC 間のギャップを示します。 一方、NH2-PS ナノプラスチック治療では内皮漏出性は観察されませんでした。 スケールバー: 20 μm。 ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。

さらに、HUVEC を両方のタイプのナノプラスチックに、異なる濃度と処理期間で曝露しました。 特に、0.05 mg/mLのNH2-PSナノプラスチックにHUVECを1時間曝露しても細胞生存率には影響しませんでしたが、ナノプラスチックの用量とインキュベーション時間の増加に伴って細胞死亡率が大幅に増加しました（図3c）。 比較すると、負に帯電した PMMA ナノプラスチックは、より優れた生体適合性と無害性を示しました (図 3d)。 さらに、VE-カドヘリン結合の破壊を観察し、ナノプラスチックによって引き起こされるNanoELを定量化するために、VE-カドヘリンの免疫蛍光染色が使用され、HUVECの内皮単層の透過性がトランスウェルアッセイによって測定されました（図3e〜gおよび補足図12）。 。 具体的には、PMMA ナノプラスチックは、0.05 mg/mL の低濃度で 1 時間で NanoEL を誘導する能力をすでに示しており、これはナノプラスチックの濃度と曝露時間が増加するにつれてより顕著になりました。 当然のことながら、NH2-PS ナノプラスチックは内皮漏出性にほとんど影響を与えませんでした。 全体として、これらの結果は、PS と PMMA の両方について、サイズ 20 ～ 60 nm の負に帯電したナノプラスチックによって NanoEL が引き起こされる可能性があることを示しています。

ROS の産生は細胞毒性の特徴です 22。 多くの金属酸化物ナノ粒子は細胞 ROS を誘発する可能性があり 23、細胞骨格損傷を介して間接的に内皮漏出を引き起こす可能性があります 24。 一方、漏出性の発生には細胞への取り込みは必要ありません21。 関連するバイオマーカーの中で、4-アミノ-5-(4-メチルフェニル)-7-(t-ブチル)ピラゾロ[3,4-d]-ピリミジン (PP1) は、VE-カドヘリンのリン酸化を阻害する Src キナーゼ阻害剤です25、rho β-関連プロテインキナーゼ (ROCK) 阻害剤 Y-27632 は細胞骨格ネットワークの混乱を防ぎ 26、N-アセチル-L-システイン (NAC) は ROS 生成を阻害します。 エンドサイトーシス阻害剤のメチル-β-シクロデキストリン（MβCD）とモノダンシルカダベリン（MDC）はPSナノプラスチックによって引き起こされる漏れを防ぐことができず、PP1とY-27632はプロセスを停止させる可能性があることがわかりました（図4a）。 HUVECをPSナノプラスチックで1時間処理した後、ROSレベルの大幅な増加が観察されました（補足図2）。 ナノプラスチック（0.05 mg/mL）にさらす前に、細胞を抗酸化剤 NAC（5 mM）またはエンドサイトーシス阻害剤 MβCD（5 mM）および MDC（10 μM）で 1 時間処理した場合、漏出性のレベルに有意な差はありませんでした。 １時間放置した（図４ｂ）。 しかし、PS グループと比較して、PP1 グループおよび Y-27632 グループの漏れレベルは有意に減少しました (P < 0.05 または P < 0.001)。 細胞を0.5 mg/mL PSナノプラスチックで処理することにより、一貫した結果が得られました（図4c）。 上記の現象は、PS ナノプラスチック誘発の内皮漏出性が ROS 形成およびエンドサイトーシスとは無関係であるが、VE-カドヘリン経路およびアクチン リモデリングに関連していることを示しました。

a 阻害剤または ROS 阻害によるエンドサイトーシスの遮断は、PS ナノプラスチックの漏れを防止しませんでした。 しかし、Src キナーゼ阻害剤 PP1 および ROCK 阻害剤 Y-27632 は、PS ナノプラスチックの漏洩性に影響を与えました。 HUVEC を Src キナーゼ阻害剤 PP1 (10 μM)、rho 関連プロテインキナーゼ (ROCK) 阻害剤 Y-27632 (10 μM)、エンドサイトーシス阻害剤 (5 mM メチル-β-シクロデキストリン (MβCD) および 10 μM モノダンシルカダベリン (MDC)) で処理しました。 ）、または ROS 阻害剤（5 mM N-アセチル-L-システイン（NAC））を 1 時間投与した後、b 0.05 mg/mL または c 0.5 mg/mL PS ナノプラスチック処理を行います。 PP1 および Y-27632 は、阻害剤処理を行わなかったそれぞれの対応物と比較して、FITC デキストラン透過の倍数を大幅に減少させました。 MβCD、MDC、または NAC は、阻害剤処理なしのそれぞれの対応物と比較して、FITC デキストラン透過の倍率を有意に減少させることはありませんでした。 データは平均値 ± SD として表されます。 生物学的に独立したサンプルを使用しました (n = 3)。 統計分析は、一元配置分散分析とそれに続く Tukey の多重比較検定を通じて実行されました。 導出された P 値がパネルに挿入されました。 VE-カドヘリンおよびそのリン酸化レベルのウェスタンブロット分析: d 0.05 mg/mL または e 0.5 mg/mL PS ナノプラスチック処理は、Y658 および Y731 で VE-カドヘリンのチロシンリン酸化を誘導しました。 しかし、PP1は、PSナノプラスチックによって誘導されるVE-カドヘリンのY658およびY731のリン酸化を効果的に阻害した。 f 半定量分析により、PS ナノプラスチック (0.05 または 0.5 mg/mL) に曝露された VE カドヘリン (VEC) シグナル伝達の活性化が明らかになりました。 データは平均値 ± SD (n = 3 の生物学的に独立した実験) として表されます。 統計分析は、二元配置 ANOVA とそれに続く Tukey の多重比較検定を通じて実行されました。 導出された P 値がパネルに挿入されました。 ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。

成熟した血管における内皮細胞の自然な状態は、融合した静的な単層であり、VE-カドヘリンが細胞間の接触部に集まり、対応する組織に接着します27。 VE-カドヘリンは、血管新生中の内皮細胞における細胞骨格の再構成 28 と密着結合のリモデリング 29 に寄与します。 VE-カドヘリンには他の機能もありますが、主な機能は内皮細胞間の接着を促進し、結合が破壊された場合に細胞透過性を高めることです27。 チロシンキナーゼ Src は、VE カドヘリンの Y658 および Y731 残基のリン酸化を活性化します 30。 VE-カドヘリンは、細胞質尾部を介して p120 および β-カテニンと相互作用し、細胞接着を促進します 31。 VE-カドヘリンの細胞質尾部のチロシンリン酸化は、p120の結合を破壊し、VE-カドヘリンと細胞質カテニンの間の相互作用を不安定化し、それによってリン酸化されたVE-カドヘリンの側方変位を通じてギャップを形成します32。 PP1を使用して、PSナノプラスチックがSrcキナーゼを活性化してVE-カドヘリンリン酸化を誘導するかどうかを検出しました。 0.05または0.5 mg/mLのPSナノプラスチックで処理したHUVECの場合、PP1はY658およびY731残基でのVE-カドヘリンのリン酸化を防止しました（図4d、e）。 PS ナノプラスチック導入 (0.05 または 0.5 mg/mL) の前に細胞を PP1 (10 μM) で 1 時間処理した場合、VE カドヘリンの Y658 および Y731 残基のリン酸化レベルは大幅に減少しました (1 、3または6時間）（図4f）。 我々のデータはさらに、PS ナノプラスチックが VE-カドヘリンのリン酸化を引き起こす可能性があり、これにより細胞間ギャップが増大し、漏出性が誘発される可能性があることを示しました。 さらに、PMMA（0.05または0.5 mg/mL）もVE-カドヘリンのリン酸化を誘導することを発見しました（補足図13）。

PS ナノプラスチックによって誘発される VE カドヘリン二量体の破壊を特徴付けるために、陰的溶媒モデルを使用した全原子離散分子動力学 (DMD) シミュレーションを実行しました。 in silico で引張力を加える前に、カドヘリン二量体と PS ナノプラスチックの結合シミュレーションを最初に実行しました。 EC1二量体のドメイン交換領域は細胞間の接着に重要であるため、全長VEカドヘリンの最初の細胞外ドメイン（EC1）二量体を使用しました21（図5a）。 次に、カルボキシル表面基を有する PS ナノプラスチックを構築し、NanoEL での能力を調査しました。 PSのサイズが大きいことに関連する計算コストが高いため、20の繰り返しPS鎖で構成されるPSナノプラスチックをモデル化し、形成されたナノプラスチックの直径は、50 nsの平衡DMDシミュレーションで約15Åに相当しました（図5b）。 同様のサイズの非荷電 PS 鎖は、細胞と直接相互作用し、細胞膜を貫通することが計算と実験の両方で示されています 33,34。 ここでは、負に帯電した脂質を含む細胞膜との直接相互作用を最小限に抑えるために、カルボキシル基で修飾された負に帯電した PS を実験と同様にモデル化しました。 続いて、構築されたナノプラスチックを EC1 二量体からランダムに配置し、30 の独立した結合シミュレーションを実行して、PS ナノプラスチックと EC1 カドヘリン 二量体の結合部位を特定しました。 計算された結合頻度は、50 ns後、PSナノプラスチックがVE-カドヘリン二量体の残基32〜38、42、46〜51、および76〜81に強く結合したことを示しました（補足図14a）。 ナノプラスチックの結合頻度に従って色分けされた二量体の表面表現によって示されるように、これらの領域は二量体の界面領域から離れて位置し、正に帯電した残基が豊富でした（図5c）。 結合頻度データは、PS ナノプラスチックが二量体のターン領域近くで優先的に結合することを示唆しました。 一方、未修飾のPS鎖は、疎水性相互作用により二量体界面（残基1〜4、85〜89）に結合しました（補足図15a、b）。 したがって、PS ナノプラスチックの表面のカルボキシル基と二量体のターン領域の正に帯電した残基との間の静電相互作用により、2 つの実体の会合が引き起こされました。

a EC1 カドヘリン二量体の構造。 赤い棒と灰色の球は、それぞれドメイン交換領域とカルシウムイオンを示します。 b 50 ns 平衡 DMD シミュレーション後のカルボキシル化 PS ナノプラスチックの構造。 c EC1 カドヘリン二量体表面上の PS ナノプラスチックの色分けされた結合頻度。 青と赤の色は、低い結合頻度から高い結合頻度を表します。 拡大パネルは、EC1 二量体とのナノプラスチック結合を詳細に示しています。 d PS ナノプラスチックと結合するダイマーのバイオリン プロット。 e 0 pNの引張下でのPSナノプラスチックの存在下での二量体の代表的な解離軌跡。

結合シミュレーションに加えて、カドヘリン二量体の安定性およびカドヘリン解離に対する PS ナノプラスチックの影響を決定するために、ステアード DMD (sDMD) シミュレーションをさらに実行しました。 ここでは、カドヘリン二量体の安定性を測定するために、金ナノ粒子による EC1 二量体の破壊に十分な低力範囲 (0 ～ 20 pN) を考慮しました 21。 EC1ドメインの1つを固定化し、関連するEC2ドメインに向かう方向を向けて他のEC1ドメインに一定の力を加えました（補足図14b）。 適用された力の各ケースについて、最初にランダム化された速度を使用した 30 の独立した sDMD シミュレーションが 100 ns にわたって実行されました。 sDMD シミュレーションでは、カドヘリン二量体間の原子接触の数がゼロに減少したときのカドヘリン二量体の最初の平均解離時間を計算しました。 バイオリンプロットは解離時間の関数として得られ、一定の力を加えました（図5d）。 我々は、PS ナノプラスチックが、PS ナノプラスチックを含まないカドヘリンの対照と比較して、高い確率で早期 EC1 二量体解離を誘導することを発見しました。 加えられる力の大きさが増加するにつれて、解離時間が短い確率が高くなることが観察された。 代表的な軌跡により、結合したナノプラスチックがカドヘリン二量体の早期解離を引き起こすことが明らかになりました（図5e）。 対照的に、未修飾のPS鎖の二量体界面への結合は二量体を不安定化しなかった(補足図15c)。 PS ナノプラスチックによって引き起こされるカドヘリン二量体の安定性の低下を確認するために、力を加えずにシミュレーションの最初の 30 ns で二量体の柔軟なドメインの二量体角度と二乗平均平方根変動 (RMSF) の分布をさらに計算しました (補足)図１４ｃ、ｅ）。 我々は以前、無機金ナノ粒子がEC1二量体を安定状態（sダイマー）から中間状態（xダイマー）に移行させる一方、カドヘリンダイマーのエントロピーを低下させてその固有の機能を破壊することを発見した21。 今回の研究では、PSナノプラスチックの結合が二量体の状態をs-二量体からx-二量体に変化させ、二量体の柔軟性を低下させることにより、同様の分子機構を介してカドヘリン二量体を不安定化させることが計算結果から示唆された。

PS に加えて、PMMA ナノプラスチックがどのようにカドヘリン二量体の破壊を誘発するのかについても調査しました。 複合反復のサブセットのメチル基を除去することによって修飾された負に帯電した20mer PMMAは、50 nsの平衡DMDシミュレーション後にコンパクトな小球を形成することがわかりました（補足図16a）。 50 ns の結合 DMD シミュレーションにより、PMMA とカドヘリン二量体の結合頻度を計算しました。 PMMAナノプラスチックは、PSナノペーストと同様にカドヘリンの同じターン領域に対して同様の強い結合を持ちましたが（図5a）、二量体の界面領域に対しては弱い結合もありました（補足図16b、c）。 PMMAナノプラスチックを使用したカドヘリン二量体のその後のsDMDシミュレーションでは、PMMAナノプラスチックも低い力の下でカドヘリン二量体の解離を増加させることが示されました（補足図16d）。 興味深いことに、カドヘリンダイマー界面へのPMMAの追加結合により、カドヘリンモノマーの1つへのナノプラスチックの競合的結合を伴う代替解離経路が観察された(補足図16e)。 化学組成に関係なく、アニオン性 PS ナノプラスチックと PMMA ナノプラスチックの両方がカドヘリン二量体の解離を引き起こしました。 PS および PMMA ナノプラスチックのサイズは、計算コストを削減する必要があるため、実験のものと直接比較することはできませんでしたが、追加のシミュレーションでは、サイズが最大 80 mer まで増大した一連の PS ナノプラスチックが一貫してカドヘリンを破壊することが示されました。二量体（図5eおよび補足図17）。 したがって、大きなナノプラスチックは、VE-カドヘリン二量体との相互作用において同様に挙動すると予想される。 総合すると、我々のインシリコデータは、PSおよびPMMAナノプラスチックがカドヘリン-カドヘリン会合を破壊する能力があるという実験的観察を裏付け、我々のシミュレーションはさらに、ナノプラスチックの結合がドメイン間ひずみの増加とエントロピーの減少を通じてカドヘリン二量体の安定性を低下させることを明らかにした。

in vitroおよびin silico検査に加えて、PSナノプラスチックによって誘発されるこれらの血管内皮の漏出性を測定するために、ウサギおよびブタの血管を使用したex vivoアッセイも実施しました（図6a）。 ウサギの血管に漏出したEBDの蛍光強度は、PSナノプラスチックの濃度が増加するにつれて増加することが観察されました（図6b）。 ブタの血管でも同様の現象が観察されました（図6c）。 ブタの血管を 0.5 および 5 mg/mL の PS ナノプラスチックで 6 時間処理すると、ブタの血管の漏出性が対照と比較して有意に増強されました (P < 0.001)。 同時に、エクスビボでのVE-カドヘリンのリン酸化も検出しました（補足図18）。

ex vivo構築物の概略図。 b ウサギの血管におけるエバンスブルー色素 (EBD) の浸透の濃度依存性の増加。 EBD の定量化により、0.05 および 0.5 mg/mL のポリスチレン (PS) ナノプラスチック グループが未処理のコントロールとは大きく異なることが示されました。 0.5 mg/mL PS ナノプラスチックは、0.05 mg/mL PS ナノプラスチックグループよりも多くの漏れを引き起こしました。 データは平均値 ± SD として表されます。 生物学的に独立したサンプルを使用しました (n = 3)。 統計分析は、一元配置分散分析とそれに続く Tukey の多重比較検定を通じて実行されました。 対照と比較して得られた P 値をパネルに挿入しました。 c ブタ血管における EBD 浸透の濃度依存性の増加。 EBD の浸透は、0.5 mg/mL PS ナノプラスチック グループよりも 5 mg/mL PS ナノプラスチック グループの方が顕著でした。 データは平均値 ± SD (n = 3 の生物学的に独立したサンプル) として表示され、一元配置分散分析とそれに続く Tukey の多重比較検定によって分析されます。 対照と比較して得られた P 値をパネルに挿入しました。 d 雄のスイスマウスに、PS ナノプラスチック (1.5、15、または 30 mg/kg) を含む 10 mM EBD 溶液を静脈内注射しました。 対照マウスには、10 mM EBDの静脈内注射を1回受けた。 24 時間後、マウスを屠殺し、画像化のために臓器を採取しました。 ナノプラスチックの用量が増加すると、蛍光シグナルが黄色から赤色に徐々に増加しました。 EBD 漏洩の程度が大きいほど、蛍光シグナルが強くなります。 e PS ナノプラスチックはマウスの皮下血管の漏出を促進しました。 PS ナノプラスチック (30 mg/kg) をマウスの背中の皮下ポケットに注射しました。 EBDを尾部静脈内注射によって注射した。 EBD の定量化により、未治療マウス グループと比較して PS グループでより多くの内皮漏出性が示されました。 データは平均値 ± SD (n = 3 生物学的に独立した動物) として表され、両側スチューデント t 検定によって分析されます。 対照と比較して得られた P 値をパネルに挿入しました。 ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。 (パネル a の一部のアート要素は、smart.servier.com からのものです)。

我々は、PS ナノプラスチックによって in vivo で誘発される内皮漏出性をさらに研究しました。 ナノ粒子の静脈内送達を使用する研究では、ナノ粒子は主に肝臓や脾臓などに蓄積します 35,36。 私たちの実験では、PS ナノプラスチックを含む EBD 溶液をマウスに静脈注射しました。 24 時間後、PS ナノプラスチックの用量 1.5 mg/kg、15 mg/kg、および 30 mg/kg では、EBD の漏洩が主にマウスの脳、肝臓、脾臓、肺に存在することが観察されました (図6d)。 腎臓と横隔膜では、漏出した EBD の少量の蛍光も見られました。 組織内に漏出したEBDの蛍光強度を定量的に分析しました。 心臓を除いて、脳、肝臓、脾臓、肺、腎臓、横隔膜の漏出EBDの蛍光強度は、PSナノプラスチックの導入により大幅に増加しました（補足図19）。 内皮細胞は、循環とその下の組織の間に物理的な障壁を提供します。 しかし、特定の刺激は内皮バリアの部分的な破壊を引き起こす可能性があり、それによって循環から基底レベルを超えて間質への体液の溢出が増加します37。 透過性の長期的な増加は細胞間結合を破壊する可能性があり、その結果、血管の完全性が変化します27。 PS ナノプラスチックが皮下血管の漏れを引き起こす可能性があるかどうかを調査するために、マウスの尾静脈に EBD を注射し、続いてビヒクル対照 PBS 緩衝液または PS ナノプラスチックのいずれかを皮下ポケットに注射しました。 PSナノプラスチックは、定量化に基づいて皮下血管系でEBD血管外漏出を引き起こし、それによって内皮漏出性の発生を確認しました（図6e）。

化石プラスチックのライフサイクルや二酸化炭素排出量などの環境負荷を理解することは、今日世界が直面している大きな課題です。 この課題は、工業規模でのプラスチック生産の存在感がますます増大していることと、自然環境中でのプラスチックの劣化が著しく緩やかであることによって課せられています。 実際、生態圏での直接曝露または栄養移動を介して、プラスチックが人間の健康に及ぼす潜在的な悪影響は依然として不明である。 これは特に、人間と自然の力によってプラスチックの最終形態として考えられるナノプラスチックに当てはまりますが、その生物学的影響は近年明らかになり始めています。 この研究では、共焦点蛍光イメージング、トランスウェルアッセイ、HUVCE、ウサギおよびブタの血管、およびマウスによるシグナル伝達経路、ならびに仮想力顕微鏡の技術によって特徴付けられる、アニオン性ポリスチレンおよびPMMAナノプラスチックによって誘発される内皮漏出性の発見を文書化しました。コンピューターシミュレーションのこと。 内皮漏出性は、ポリマーナノ粒子と結合した内皮細胞のVE-カドヘリン接合部の立体配座および構造変化によって媒介され、影響を受けた細胞のROS産生、オートファジー、およびアポトーシスとは無関係に、両タイプのナノプラスチックへの細胞曝露に対する用量および時間依存性を示した。 。 内皮漏出の発生は、ナノプラスチックが体に広がる血管系の内外に浸透する可能性があることを示唆しているため、この発見は、環境中に密集する合成プラスチック材料の安全性と生物学的フットプリントを理解する上で重大な意味をもたらす。

すべての動物実験は、NIH のガイドラインに従って動物実験および研究に関する倫理規定を遵守し、サウスウェスト大学の施設内動物管理使用委員会 (IACUC) によって承認されました (参照 (ID 番号) IACUC-20200525-01)。

PS (30 nm カルボキシル化 PS ビーズ、カタログ番号 L5155、Sigma-Aldrich、米国)、NH2-PS (30 nm アミノ化 PS ビーズ、カタログ番号: PSGF00030、Zhongke Detong Inc、中国)、および PMMA (50 nm) の TEM イメージング用カルボキシル化 PMMA、カタログ番号: BKPMMA50、Beikenami Inc、中国) ナノプラスチック、5 µL のサンプルをグロー放電したフォームバール/カーボン コーティング銅グリッド (400 メッシュ、ProSciTech) 上に滴下しました。 1 分間のインキュベーション後、グリッドを乾燥させ、10 μL の Milli-Q H2O で洗浄し、5 μL の酢酸ウラニル (UA、1 %) でネガティブ染色しました。 サンプルは、200 kV で動作する FEI Tecnai F20 で画像化されました。 サイズ分布は、ImageJ 1.53c ソフトウェアによって分析されました。 PS、NH2-PS、および PMMA ナノプラスチックの流体力学的直径は、室温で Zetasizer Nano-ZS (Malvern) を使用した動的光散乱 (DLS) によって決定されました。 ナノプラスチックの表面元素組成と化学状態は、X 線光電子分光法 (XPS、Thermo escalab 250X、米国) を使用して同定されました。 PS、NH2-PS、および PMMA ナノプラスチックは、凍結乾燥機 (Alpha2-42DPlus、Christ) によって凍結乾燥されました。 次に、粉末サンプルを導電性接着剤でサンプルステージに接着し、真空引きした後にテストしました。

ヒト臍帯静脈内皮細胞 (HUVEC、CRL-1730) は、American Type Culture Collection (ATCC、米国) から入手し、10% ウシ胎児血清 (FBS、ギブコ、米国）。 細胞は、空気中 5% CO2 の加湿雰囲気中、37 °C でインキュベートされました。 細胞がコンフルエントに達したら、0.25% トリプシンを使用して細胞を 4 分間消化しました。 次いで、トリプシンを除去し、血清含有培地を混合物に導入して消化を停止した。 細胞をピペットで取り除き、遠心分離し、新しい培地に再懸濁しました。

約 1 × 106 細胞/ウェルを 6 ウェルプレートに一晩播種し、続いて PS ナノプラスチックまたは NH2-PS ナノプラスチックを 0.05 または 0.5 mg/mL で 1、3、または 6 時間処理しました。 次に細胞を PBS で洗浄し、BD FACS MelodyTM フローサイトメトリーを使用して分析しました。 3 つの独立した実験から各サンプルについて合計 1 × 104 のイベントが取得されました。 データはFlowJo_V10で解析しました。

約 1 × 106 細胞/ウェルを 6 ウェルプレート上で増殖させ、PS ナノプラスチック (0.05、0.1、0.25、および 0.5 mg/mL) に 1、3、または 6 時間曝露しました。 対照群の細胞は、1、3、または6時間無血清培地処理を受け、その後DCFH-DA（Sigma-Aldrich、米国）指示薬とともに暗所、37℃で30分間インキュベートされました。 細胞をリン酸緩衝食塩水(PBS)で2回洗浄した。 細胞の蛍光は、BD FACS MelodyTM フローサイトメーターによって分析されました。 実験は独立して 3 回繰り返されました。 データはFlowJo_V10で解析しました。

HUVEC (5 × 104 細胞/ウェル) を黒色透明底 96 ウェル プレート (Corning Costar、米国) に播種し、37 °C で 48 時間培養しました。 古い培地を、1 × 10-6 M ヨウ化プロピジウム (PI、Sigma-Aldrich、米国) を含む新鮮な ECM に置き換えました。 30 分間のインキュベーション後、細胞をさまざまな濃度の PS ナノプラスチック (0、0.05、0.1、0.25、および 0.5 mg/mL) に曝露しました。 続いて、生細胞チャンバー (37 °C、5% CO2) を備えた Operetta (20× PlanApo 対物レンズ、開口数 NA = 0.7、PerkinElmer) を使用して、細胞形態と死細胞の数を 22 時間測定しました。 細胞死亡率は、Harmony High-Content Imaging and Analysis ソフトウェア (PerkinElmer) の明視野マッピング機能から導出された総細胞数に対する PI 陽性細胞によって計算されました。 HUVEC (5 × 103 細胞/ウェル) を 96 ウェル プレートに一晩播種した後、PS、NH2-PS、および PMMA ナノプラスチック (0.05 および 0.5 mg/mL) で 1 時間、3 時間、および 6 時間処理しました。 陰性対照を新鮮な培地に 1、3、または 6 時間曝露しました。 ポジティブコントロールを 200 μM H2O2 に 1、3、または 6 時間曝露しました。 続いて、100μLの培地および10μLのCCK8試薬を各ウェルに添加し、37℃で2時間インキュベートした。 各培養ウェルの吸光度を、マイクロプレートリーダー（BioTek、米国）を用いて450nmの波長で測定した。

HUVEC を 1 × 106 細胞/ウェルの濃度で 6 ウェル プレート (Dingjin、中国) に播種しました。 オートファジーシグナル伝達経路については、細胞をPSナノプラスチック（0.05または0.5 mg/mL）でさまざまな時間（1、3、または6時間）処理し、陰性対照を新鮮な培地に1、3、または6時間曝露しました。 PS ナノプラスチック (0.05 または 0.5 mg/mL) で 6 時間処理する場合、陰性対照を新鮮な培地に 6 時間曝露しました。 アポトーシスシグナル伝達経路アッセイでは、細胞を PS ナノプラスチック (0.05 または 0.5 mg/mL) で 6 時間処理し、陰性対照を新鮮な培地に 6 時間曝露しました。 VE-カドヘリンシグナル伝達経路アッセイでは、細胞を Src キナーゼ阻害剤 PP1 (10 μM) で 1 時間処理した後、PS ナノプラスチック (0.05 または 0.5 mg/mL) で 1、3、または 6 時間処理しました。 PP1 を含まないグループは、PS ナノプラスチック (0.05 または 0.5 mg/mL) 処理のみを含む新鮮な培地に 1、3、または 6 時間曝露されました。 ネガティブコントロールを新鮮な培地に曝露した。 VE-カドヘリンシグナル伝達経路アッセイでは、細胞を PMMA ナノプラスチック (0.05 または 0.5 mg/mL) で 1、3、または 6 時間処理しました。 PBSで3回洗浄した後、細胞を溶解緩衝液を用いて氷上で10分間溶解した。 ex vivo モデルにおける VE-カドヘリンシグナル伝達経路アッセイでは、ウサギおよびブタの血管を 4 °C でホモジナイズし、10,000 g、4 °C で 20 分間遠心分離し、上清を収集しました。 細胞溶解物のタンパク質濃度は、Carmassi Bradford 法を使用して測定されました。 各グループの細胞タンパク質を、標準的な 8% または 12.5% または 15% ドデシル硫酸ナトリウム ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (SDS-PAGE) によって分離し、ニトロセルロース メンブレン (PALL、米国) にブロットしました。 メンブレンを 5% スキムミルクで室温で 2 時間ブロックし、次に対応する一次抗体とともに室温で 3 時間インキュベートしました。 メンブレンを Tween 20 (Biofroxx、ドイツ)/Tris 緩衝生理食塩水 (TBST) で洗浄し、ビオチン化ヤギ抗ウサギ IgG (H + L) またはビオチン化ヤギ抗マウス IgG (H + L) 抗体とインキュベートしました (1: 2000 倍希釈、Sangon、中国) で 1 時間、HRP 標識ストレプトアビジン抗体 (1:5000 希釈、Sangon、中国) で室温で 1 時間反応させました。 膜は電気化学発光 (ECL) システムで視覚化されました。 代表的な画像は、少なくとも 3 つの独立した実験から選択されました。 タンパク質バンドの画像は、ImageJ 1.53c ソフトウェアを使用して半定量的に分析されました。 ブロットのトリミングされていないスキャンは、ソース データ ファイルで提供されます。 一次抗体と二次抗体は補足表 2 にリストされています。

HUVEC を 1 × 106 細胞/ウェルの濃度で 6 ウェル プレート (Dingjin、中国) に播種しました。 細胞を PS ナノプラスチック (0.05 または 0.5 mg/mL) で 6 時間処理しました。 次いで、細胞を溶解し、総RNA精製キット(BioTeke、中国)を用いたRNA抽出のために収集した。 精製したRNAを、転写第一鎖cDNA合成キット(Yeasen、中国)を用いてcDNAに逆転写した。 次に、リアルタイム PCR 装置 (Roche、スイス) で 2x SYBR Green qPCR Master Mix (Bimake、米国) を使用した RT-qPCR 分析によって cDNA を分析しました。 3 つの独立した実験からのデータは、内部標準として β-アクチンを使用して分析されました。 増幅に使用したプライマーを補足表 3 に示します。

HUVEC を共焦点ディッシュに 8 × 104 細胞/ウェルの密度で播種し、24 時間培養しました。 細胞を PS ナノプラスチック (0.05 または 0.5 mg/mL) で 6 時間処理しました。 次に、細胞を DAPI (200 μL) で 10 分間染色しました。 PBSで3回洗浄した後、共焦点蛍光顕微鏡(Nikon、N-SIM E)を使用して細胞の形態学的特徴を捕捉した。

HUVEC (5 × 105 細胞/ウェル) を 8 ウェルチャンバースライドに播種し、5 ～ 6 日間培養して無傷の単層を形成しました。 次に、新鮮な細胞培地中の 0.05 および 0.5 mg/mL の PS ナノプラスチック、NH2-PS、および PMMA をウェルに添加し、細胞とともに 1、3、または 6 時間インキュベートしました。 その後、細胞をハンクス平衡塩類溶液 (HBSS、Sigma Aldrich、米国) で注意深く 2 回洗浄し、さらに 4% パラホルムアルデヒド (PFA、Sigma Aldrich、米国) で室温で 15 分間固定しました。 ＰＢＳで洗浄した後、０．１％サポニンおよび５％ウマ血清を含むＰＢＳを用いて室温で１時間細胞をブロックした。 続いて、免疫染色を利用して、VE-カドヘリンおよびアクチンフィラメントの発現を誘発した。 5%ウマ血清/PBS中の1:400のウサギポリクローナル抗VE-カドヘリン抗体をチャンバーウェルに添加し、4℃で一晩インキュベートした。 PBSで洗浄した後、細胞を二次抗体溶液(0.1%ファロイジン-iFluor 488を含むPBS中1:500のロバ抗ウサギAlexa Fluor 594)とともに室温で2時間インキュベートした。 次いで、ＰＢＳ中１：２，０００のＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）を細胞に添加し、５分間インキュベートした。 次いで、６３倍の油対物レンズを備えた共焦点蛍光顕微鏡（ＳＰ８ ＬＩＧＨＴＮＩＮＧ、Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、チャンバースライドを画像化した。 ギャップ領域およびアクチン強度の半定量的画像分析は、ImageJ 1.53c ソフトウェアを使用して実行されました。

HUVEC をトランスウェルインサート (ポリカーボネート膜、孔径 0.4 μm、Corning Costar、米国) に約 8 × 104 個の細胞とともに播種し、約 100% コンフルエントに達するまで 4 日間増殖させて無傷の単層を形成しました。 次に、細胞を PS (0.05、0.1、0.25、および 0.5 mg/mL)、NH2-PS (0.05 および 0.5 mg/mL)、または PMMA (0.05 および 0.5 mg/mL) ナノプラスチックで 1、3、または 6 時間処理しました。 薬学的阻害アッセイでは、細胞を対応する阻害剤、エンドサイトーシス阻害剤 5 mM メチル-β-シクロデキストリン (MβCD、Solarbio、中国) または 10 μM モノダンシルカダベリン (MDC、Sigma Aldrich、米国)、10 μM ROCK 阻害剤 Y-27632 (Yuanye) で処理しました。 、中国）、PS ナノプラスチック（0.05 または 0.5 mg/mL）の前に 10 μM Src キナーゼ阻害剤 PP1 (Yuanye、中国) または 5 mM ROS 阻害剤 N-アセチル-L-システイン (NAC、Sigma Aldrich、米国) を 1 時間投与1時間の治療。 阻害剤を含まないグループは、PS ナノプラスチックのみを含む新鮮な培地に 1 時間曝露されました。 ネガティブコントロールを新鮮な培地に1時間曝露しました。 処理後、細胞をＰＢＳで２回注意深く洗浄した。 最終濃度１ｍｇ／ｍＬのＦＩＴＣ－デキストラン（平均分子量４０，０００、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、米国）１００μＬを各ウェルに添加し、３０分後に下部コンパートメントからの培地を収集した。 蛍光強度は、マイクロプレートリーダーを用いて495nm/519nmの励起/発光で測定した。 ネガティブコントロールグループからの読み取り値を使用して、他のグループの読み取り値を正規化しました。

HUVEC を 96 ウェルプレート (黒色/透明底、Corning Costar、米国) に約 5 × 104 細胞/ウェルで播種し、37 °C で 48 時間インキュベートしました。 次に、細胞を PS ナノプラスチック (0.05、0.1、0.25、および 0.5 mg/mL) でさまざまな時間 (1、3、および 6 時間) 処理しました。 対照群の細胞は、異なる時間（1、3、および6時間）無血清培地処理を受けました。 細胞内蛍光は、Operetta (PerkinElmer、20× PlanApo 顕微鏡対物レンズ、開口数 NA = 0.7) を使用して測定しました。

HUVEC のコンフルエントな単層を PS ナノプラスチック (0.05 および 0.5 mg/mL) でさまざまな時間 (1、3、および 6 時間) 処理しました。 次に、タンパク質を溶解バッファーで抽出しました。 PS ナノプラスチックとその関連タンパク質を遠心分離 (10,000 g、20 分、4 °C) によって引き下げました。 PS ナノプラスチックを RIPA バッファーで 3 回洗浄し、ローディングバッファー中 97 °C で 10 分間、関連タンパク質を PS ナノプラスチックから変性させました。 溶解後のプルダウン実験では、HUVEC を溶解し、PS ナノプラスチック (0.05 および 0.5 mg/mL) またはプロテイン A/G 磁気ビーズ (Bimake、米国) を添加しました。 次に、混合物を 4 °C で 1 時間穏やかに振盪しました。 その後、関連タンパク質を含む PS ナノプラスチックまたはプロテイン A/G 磁気ビーズを遠心分離 (10,000 g、20 分、4 °C) によって引き下げ、RIPA バッファーで 3 回洗浄しました。 タンパク質を標準的な 8% SDS-PAGE で分離し、ポリフッ化ビニリデン (PVDF) 膜に転写しました。 次に、VE-カドヘリン (1:1000; Abcam、米国) および α-チューブリン (1:2000; Proteintech、中国) に対する抗体で膜をプローブしました。

全原子離散分子動力学（DMD）は、タンパク質のフォールディング、ペプチドの凝集 38,39,40、タンパク質の構造と動力学 41,42、ナノ粒子とタンパク質の相互作用 21,43,44 などの生体分子の研究に広く使用されています。 DMD は分子動力学 (MD) の特殊なクラスであり、力場が従来の MD シミュレーションからの離散ステップ関数として再モデル化されます 45。 具体的には、この研究における DMD シミュレーションの原子間ポテンシャルは、結合 (つまり、結合、結合角、二面角) 項と非結合 (つまり、ファン デル ワールス結合、静電結合、溶媒和結合、および水素結合) の項で構成されていました。 。 非結合項では、CHARMM 力場 46 とデバイ・ヒュッケル近似がそれぞれファンデルワールス項と静電項に適用されました。 非結合パラメーターの溶媒和は、Lazaridis と Karplus によって開発された EEF1 暗黙的溶媒モデルによって採用され 47、水素結合は反応様アルゴリズムによってモデル化されました 48。

カドヘリンはカルシウム依存性タンパク質であり、細胞間の接着のための主要なタンパク質の 1 つです。 トランス二量体は、細胞間の接着に関与する2つの対向する細胞に由来するカドヘリンタンパク質によって形成されることが知られています。 私たちは、主に最初の細​​胞外ドメイン (EC1) ドメインのドメイン交換領域によって形成されるトランス相互作用に焦点を当てました。 EC12 カドヘリン二量体のクライオ EM モデルからの EC1 カドヘリン二量体 (PDB ID: 3PPE49) を使用しました。 天然EC1二量体の構造安定性を確保するために、N末端（すなわち、残基1〜5）を含むドメイン交換領域は、それぞれGōポテンシャルを適用することによって拘束されました（図5a）。 ここでは、Gō 制約は、0.3 kcal/mol (〜0.5 kBT) の弱い接触エネルギーで接触する残基の Cβ 原子間にのみ割り当てられました。 ループの Ca2+ 配位 (すなわち、残基 Glu11、Asp62、Glu64、Asp96、および Asp99) は、配位酸素原子間のペア結合制約によってモデル化されました。 次に、それぞれカルボキシル表面基を持つ PS および PMMA ナノプラスチックを構築しました。 反復 20 個のスチレン モノマーで構成される PS チェーンが準備され、50 ns の DMD シミュレーション用に緩和および平衡化されました。 純粋な PS 鎖がコンパクトな粒子を形成したら、PS 鎖にカルボキシル基を追加し、その後 50 ns の DMD シミュレーションを実行しました。 PMMA ナノプラスチックは、PS ナノプラスチックの方法に従ってモデル化されました。 カルボキシル基が露出したコンパクトな構造として維持された、カルボキシル基を有する長いPSおよびPMMA鎖を構築しました（図5bおよび補足図16a）。 続いて、ナノプラスチックを 120 nm3 立方体ボックス内で少なくとも 12 Å 離れた EC1 カドヘリン二量体の近くにランダムに分布させ、結合シミュレーションを実行しました。 シミュレーション中、EC1 二量体の主鎖は拘束され、その側鎖は PS および PMMA ナノプラスチックと自由に相互作用しました。 DMD シミュレーションを実行するには、50 fs/ステップの単位シミュレーション時間と 1 kcal/mol の対応するエネルギーを使用し、アンダーソンのサーモスタットで 300 K の温度を維持しました。 50 ns の独立した DMD シミュレーションを 30 回実行し、合計 1.5 μs の累積シミュレーションを実行しました。 結合シミュレーション後、PS および PMMA ナノプラスチックと EC1 カドヘリン二量体との結合頻度がシミュレーションの最後の 20 ns から計算されました。 カットオフ距離 0.65 nm を割り当てて、EC1 カドヘリン二量体と PS および PMMA ナノプラスチック間の原子接触を取得し、それらの結合頻度を計算しました。

次に、カドヘリン-PS およびカドヘリン-PMMA ナノプラスチック複合体に対する定力引張 in silico 実験を実行し、ステアード分子動力学 (sDMD) シミュレーションによって EC1-EC1 カドヘリン二量体の安定性を確認しました。 sDMD 技術は一般に、光ピンセットと原子間力顕微鏡 (AFM) を模倣し、一定の速度または一定の力の関数として生体分子を特徴付けます。 sDMD シミュレーション アプローチは、タンパク質とリガンドの結合、タンパク質とナノ粒子の複合体 21,50、およびタンパク質のアンフォールディング 51 を特徴付けることに成功しました。

sDMDシミュレーションの前に、カドヘリン-PSナノプラスチック複合体の近くに塩化物イオンを分布させて、電荷を中和し、系のすべての原子の初速度をランダム化しました。 続いて、EC1二量体の1つの骨格（ドメイン交換フラグメントを除く）を固定化し、ドメインの残りの部分は柔軟になりました（図5e）。 EC1 カドヘリン二量体の柔軟なドメインは、sDMD シミュレーション中のカドヘリン 二量体のトランス相互作用を模倣して、EC1 から EC2 方向に沿って一定の力によって引っ張られました。 sDMD シミュレーションの実行の詳細は、バインディング DMD シミュレーションと同じです。 0 ～ 20 pN の範囲で間隔力として 10 pN を適用しました。 十分なサンプリングを行うために、それぞれ 100 ns の独立した sDMD シミュレーションを 30 ケース実行しました。 我々は、pyMol (Schrödinger) を使用して、ナノプラスチックがある場合とない場合のカドヘリン二量体の解離軌跡を分析しました。

さまざまな種類のカドヘリンは、二量体化中に x-ダイマーおよび s-ダイマーとして知られる 2 つの異なる中間体およびドメイン交換されたダイマーを持ちます。 カドヘリンの結晶構造から、x ダイマーと s ダイマーのダイマー角度は、互いに対して約 0 度および 90 度であることが確認されています 21。 二量体が解離し始める前の、sDMD シミュレーションの最初の 30 ns の間、力を加えずに EC1 二量体の角度を計算しました。 EC1カドヘリンダイマーのフレキシブルドメインと固定化ドメインの両方からの、sダイマーの88番目と98番目の残基とxダイマーの92番目と99番目の残基の間の2つのベクターの内積を考慮しました。 二量体の角度は MATLAB_R2017a を使用して計算され、対応するデータ分析は Python、視覚分子動力学 (VMD)、および Grace を使用して実行されました。

トランスウェルインサートとしてウサギおよびブタの血管を使用して、血管漏出性アッセイを実施した。 生後 8 か月の雄の大型白豚 3 頭の容器が、中国重慶市の地元の食肉処理場から入手されました。 3 匹の生後 4 か月の雄ニュージーランドウサギの容器を Ensiweier Biotechnology Co, Ltd. (重慶、中国) から入手しました。 冠状動脈の血管を横方向に切断して個々の断片にし、元の膜を除去した後、市販のトランスウェルチャンバー内に配置した。 0.5 および 5 mg/mL の PS ナノプラスチックを特注のウサギまたはブタ容器トランスウェル デバイスに添加し、それぞれ 37 °C で 3 時間または 6 時間インキュベートしました。 曝露後、PS ナノプラスチック含有溶液を廃棄し、100 mM EBD (Macklin、中国) を各ウェルに添加し、さらに 1 時間インキュベートしました。 最後に、トランスウェルの下部コンパートメントからの蛍光シグナルをマイクロプレート リーダーを使用して 624 nm で定量しました。 ネガティブコントロールグループからの読み取り値を正規化に使用しました。

12 匹の 10 週齢雄スイスマウスを Ensiweier Biotechnology Co, Ltd. (重慶、中国) から入手しました。 雄のスイスマウスには、餌と水を自由に摂取させ、標準的な温度と湿度の環境で、12 時間の明暗サイクルで飼育しました。 マウスには、ＰＳナノプラスチック（１．５、１５、または３０ｍｇ／ｋｇ）含有１０ｍＭ ＥＢＤ溶液を静脈内注射した。 対照マウスには、10 mM EBD 溶液の静脈内注射を 1 回受けました。 24 時間後、マウスを屠殺し、NEWTON 7.0 イメージング システムを使用してイメージングするために臓器を収集しました。

6 匹の 10 週齢雄スイスマウスを Ensiweier Biotechnology Co, Ltd. (重慶、中国) から入手しました。 すべての in vivo マウス実験は、実験動物の管理と使用に関する NIH のガイドラインに従って実行され、Southwest University Animal Care and Use Committee によって承認されました。 雄のスイスマウスには、餌と水を自由に摂取させ、標準的な温度と湿度の環境で、12 時間の明暗サイクルで飼育しました。 雄のスイスマウスに、10 mM EBD 溶液を 1 回静脈内注射しました。 次にマウスをイソフルランで麻酔し、PBS または 30 mg/kg PS ナノプラスチックのいずれかを皮下注射しました。 マウスは、皮下注射を受けた１５分後に頸椎脱臼により屠殺された。 次いで、皮膚領域を切除して、脱イオンホルムアミドによって血管外に漏出した色素を抽出した。 最後に、各サンプルからの色素を含む上清 100 μL を 96 ウェル プレートの別のウェルに移しました。 サンプルからの蛍光シグナルは、マイクロプレート リーダーを使用して 624 nm で定量化されました。

細胞生存率、ROS 産生、in vitro および ex vivo トランスウェルアッセイ、RNA 抽出、ウェスタンブロット、共焦点顕微鏡イメージングを含む in vitro アッセイは、少なくとも 3 つの生物学的サンプル (n = 3) から得られました。 内皮漏洩の程度は、ImageJ 1.53c ソフトウェアのトレーニング可能な Weka セグメンテーション プラグインを使用して画像から導出されたギャップ領域と分布によって表されました。

データのグラフ作成と統計分析は、GraphPad Prism バージョン 9.3.1 (GraphPad Software、La Jolla) および Origin 7.5 を使用して実行されました。 すべてのデータは平均 ± 標準偏差 (SD) として表され、一元配置または二元配置 ANOVA によって分析され、各図のキャプションに示されているように Tukey の多重比較検定が続きました。 P < 0.05 は統計的に有意であるとみなされました。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Research レポートの概要をご覧ください。

それぞれの本文 (図 1 ～ 4、6) および補足図 (補足図 1、2、4、5、9 ～ 13、18、および 19) の基礎となるソース データは、ソース データ ファイルとして提供されます。 ソースデータはこのペーパーに付属しています。 図 5 と補足図 14 ～ 17 のソース データは、ウェブサーバー https://dlab.clemson.edu/research/NanoPlasticEL/ に保管されました。 s-ダイマーおよび x-ダイマーの記述データは、アクセッション コード 3PPE および 4ZT1 でタンパク質データ バンク (PDB) に寄託されました。 ソースデータはこのペーパーに付属しています。

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この研究は、中国国家重点研究開発プログラム (2021YFA1200900 CC および PCK)、広東省科学技術局 (2019GD0101 CC)、中国国立自然科学財団 (21976145 YS、21974110 YS、および 82104087 YL) によって支援されました。米国科学財団 (CAREER CBET-1553945 FD) および国立衛生研究所 (MIRA R35GM119691 FD)。

これらの著者は同様に貢献しました: Wei Wei、Yuhuan Li。

環境化学および生態毒性学国家重点研究所、中国科学院生態環境科学研究センター、北京、100085、中国

ウェイウェイ＆ヤン・ソン

発光分析および分子センシングの主要研究室、教育省、西南大学薬学部、2 Tiansheng Rd、北北区、重慶、400715、中国

ウェイウェイ

肝臓癌研究所、復旦大学中山病院、上海、200032、中国

李玉環

Drug Delivery, Disposition and Dynamics、Monash Institute of Pharmaceutical Sciences、Monash University、381 Royal Parade、Parkville、VIC、3052、オーストラリア

ユファン・リー、ニコラス・アンドリコプロス、プー・チュンケ

クレムソン大学物理学および天文学部、クレムソン、サウスカロライナ州、29634、米国

ミョンサン・リー＆フォン・ディン

同済大学環境理工学部、1239 Siping Road、上海、200092、中国

林思傑

CAS Key Laboratory for Biomedical Effects of Nanomaterials and Nanosafety、National Center for Nanoscience and Technology of China、北京、100190、中国

チェン・チュンイン

シンガポール国立大学化学・生体分子工学部、4 Engineering Drive 4、シンガポール、117585、シンガポール

デビッド・タイ・レオン

ナノメディシンセンター、グレートベイエリア国立ナノテクノロジーイノベーション研究所、136 Kaiyuan Avenue、広州、510700、中国

溥春科

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PCKがこのプロジェクトを発案しました。 PCK、DTL、YS、FD、CC、SL がプロジェクト設計に貢献しました。 YL、WW、ML、PCK が原稿を書きました。 WW と YS は、in vitro および ex vivo トランスウェル、シグナル伝達経路、ROS、オートファジー、アポトーシス、および in vivo アッセイを実施しました。 YL と NA は、TEM、DLS、ゼータ電位、共焦点蛍光顕微鏡、トランスウェル、およびギャップ領域分析を実行しました。 ML と FD は、DMD および sDMD のシミュレーションと分析を実行しました。 YL は全体的な実験データの分析と図の表現を実行しました。 著者全員が原稿の提示について話し合い、合意しました。

楊松または溥春科への対応。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Nature Communications は、この研究の査読に貢献してくれた Elena Del Favero 氏、Guang Wang 氏、および他の匿名の査読者に感謝します。 査読レポートが利用可能です

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

オープン アクセス この記事はクリエイティブ コモンズ表示 4.0 国際ライセンスに基づいてライセンスされており、元の著者と情報源に適切なクレジットを表示する限り、あらゆる媒体または形式での使用、共有、翻案、配布、複製が許可されます。クリエイティブ コモンズ ライセンスへのリンクを提供し、変更が加えられたかどうかを示します。 この記事内の画像またはその他のサードパーティ素材は、素材のクレジットラインに別段の記載がない限り、記事のクリエイティブ コモンズ ライセンスに含まれています。 素材が記事のクリエイティブ コモンズ ライセンスに含まれておらず、意図した使用が法的規制で許可されていない場合、または許可されている使用を超えている場合は、著作権所有者から直接許可を得る必要があります。 このライセンスのコピーを表示するには、http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ にアクセスしてください。

転載と許可

Wei, W.、Li, Y.、Lee, M. 他アニオン性ナノプラスチックへの曝露は内皮漏出を誘発します。 Nat Commun 13、4757 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41467-022-32532-5

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受信日: 2021 年 12 月 2 日

受理日: 2022 年 8 月 3 日

公開日: 2022 年 8 月 13 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-32532-5

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