抗菌薬への曝露順序が多剤併用の発生率に及ぼす影響

Nov 03, 2023

Scientific Reports volume 13、記事番号: 8826 (2023) この記事を引用

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多剤耐性緑膿菌 (MDRP) は、臨床現場で最も重要な病原体の 1 つです。その出現に寄与するメカニズムを解明するために、我々はすでに全ゲノム配列が解明されている緑膿菌 PAO1 を用いて MDRP を単離しました。緑膿菌感染症の治療に使用されるカルバペネム、アミノグリコシド、およびニューキノロンに耐性のある変異株が分離されました。ただし、MDRP の基準を満たしたものはありませんでした。次に、PAO1 株をさまざまな順序でこれらの抗菌剤に曝露したところ、MDRP の出現率は曝露の順序に応じて変化しました。シプロフロキサシンの前にゲンタマイシンを適用した場合、MDRP がより頻繁に出現しましたが、シプロフロキサシンを最初に適用した場合にはほとんど分離されませんでした。シプロフロキサシンに続いてゲンタマイシンに曝露すると、NfxB 変異により、RND 型多剤排出ポンプである MexCD-OprJ の発現が増加しました。対照的に、ゲンタマイシンに続いてシプロフロキサシンに曝露すると、DNA ジャイレースにさらに多くの変異が生じました。これらの結果は、キノロン耐性メカニズムのタイプが MDRP の頻度に関連しており、MDRP 発生のリスクがゲンタマイシンとシプロフロキサシンへの曝露の順序に大きく依存していることを示唆しています。

緑膿菌は、抗菌剤に対して高い固有の耐性を示す日和見病原体です。緑膿菌は、抗菌剤の不適切な使用および/または長期投与によって耐性を獲得する可能性があります。多くの多剤耐性緑膿菌株 (MDRP) が同定されており、3 つの抗菌剤、つまり広域スペクトルの β-ラクタム、アミノグリコシド、およびフルオロキノロンに対して高い耐性を示します 1、2、3。 MDRPに有効な抗生物質は限られているため、対策が重要です。

抗菌薬の適正使用を推進するためには、使用する抗菌薬と耐性獲得のメカニズムとの関係を解明することが重要です。近年、臨床分離株の分析が進み、MDRPs 1、2、3 がより詳細に理解されるようになりました。しかし、MDRP が単離されると、感受性のある親株はすでに消滅しているため、臨床現場で単離された MDRP の親株を見つけることは不可能です。したがって、臨床的に分離された MDRP のみの分析では、治療に使用される抗菌薬の種類とそれに対する耐性獲得の根底にあるメカニズムとの間の直接的な関係を明らかにすることはできません。

本研究では、全ゲノム DNA 配列が入手可能な緑膿菌 PAO1 株を使用して MDRP を単離および分析しました。 1 つまたは 2 つの抗菌剤への曝露では MDRP を分離できませんでしたが、3 つの抗菌剤への連続曝露では成功しました。したがって、MDRP は複数の耐性メカニズムを積み重ねることによって出現しました。また、抗菌薬の使用順序が MDRP の出現に影響を与える可能性があることもわかりました。

私たちは、緑膿菌 PAO1 から、臨床で緑膿菌感染症の治療に使用されるカルベニシリン (β-ラクタム)、イミペネム (カルバペネム)、ゲンタマイシンとアミカシン (アミノグリコシド)、およびシプロフロキサシンとレボフロキサシン (フルオロキノロン) に対する薬剤耐性変異体を単離しました。設定。耐性変異体の出現頻度は7.5×10−7〜1.1×10−8であった（表１）。

540 個の変異体のうち、ランダムに選択された 92 個の変異体における抗生物質耐性のスペクトルが調査されました。これらの変異体はスペクトルにより 7 つのグループに分類されました (表 2)。 68 個の変異体が多剤耐性を示しました (グループ 1 ～ 3)。これらのグループでは、薬剤耐性スペクトルは RND 型排出ポンプの基質パターンと同一または類似していました 4、5、6、7。各グループのいくつかの変異体において、RND 型排出ポンプ遺伝子の発現を RT-PCR によって調査しました。 mexA の発現はグループ 1 変異体で上方制御されました (図 1A)。 mexC の発現はグループ 2 変異体で観察されましたが、PAO1 では検出されませんでした (図 1B)。 mexX の発現はグループ 3 および 4 で上方制御されました (図 1C)。グループ 5 に分類された変異株はカルベニシリンのみに耐性を示したため、これらの株では AmpC β-ラクタマーゼが高発現していると推測されます 8。グループ 6 では、イミペネム耐性のみが観察され、外膜ポリン OprD の発現が下方制御されていると推測されました 9,10。グループ 7 変異体はシプロフロキサシンおよびレボフロキサシンに対する耐性を示し、DNA ジャイレースまたはトポイソメラーゼ IV11 の変異を示しました。イミペネム変異体以外の変異体の大部分は多剤耐性を示し、多剤排出ポンプの発現が上方制御されていることが示唆された。しかし、この手順では MDRP と考えられる変異体 (イミペネムの MIC: 16 μg/ml 以上、アミカシン: 32 μg/ml 以上、シプロフロキサシン: 4 μg/ml 以上) は単離されませんでした。

RND 型多剤排出ポンプ遺伝子の発現。 (A) 上パネル: mexA、下パネル: rpsL (内部コントロール)、M: マーカー (pUC19/MspI)、1: PAO1、2: CAR204、3: CAR401、4: LV201、5: LV206、6: LV438。 (B) 上段：mexC、下段：rpsL（内部コントロール）、M：マーカー（pUC19/MspI）、1：PAO1、2：CIP101、3：CIP126、4：IC4430、5：IC4404、6：LV235、 7：LV801。 (C) 上パネル: mexX、下パネル: rpsL (内部コントロール)、M: マーカー (pUC19/MspI)、1: PAO1、2: AMK1606、3: AMK1612、4: GM458。 (D) 上段：mexX、下段：rpsL（内部コントロール）、M：マーカー（pUC19/MspI）、1：PAO1、2：GM458、3：IG4455、4：CG4401、5：CG4411、6：CgG4479、 7: ICG444391、8: ICG444242、9: CIG44408。 (E) 上パネル: mexX、下パネル: rpsL (内部コントロール)、M: マーカー (pUC19/MspI)、1: PAO1、2: CgIG44441。白破線は電気泳動写真の切断面を示す。生データは補足データに示されています。

1 つの抗生物質の単離頻度は 10-7 から 10-8 の範囲であったため、1 つの薬剤への曝露後に PAO1 から MDRP を直接単離することには困難が伴いました。したがって、我々は、MDRP が 3 種類の薬剤に連続的に曝露されることによって分離される可能性があると仮定しました。

MDRP は 1 種類の薬剤のみへの曝露では単離されなかったため、3 つの異なる薬剤への連続曝露により MDRP を単離することを試みました (図 2)。最初の曝露後、IPM429、GM458、CIP101、CIP126、および CIP131 を変異体として使用しました。 IPM429 変異体はイミペネムに対する MIC の増加を示し、ポーリンタンパク質 OprD は検出されませんでした (表 3、図 3)。一部のゲンタマイシン耐性変異体は不安定な耐性表現型を示すため、ゲンタマイシンに対して安定した耐性を示す GM458 変異体を使用してさらなる解析を実施しました。 GM458 は、ゲンタマイシン、アミカシン、シプロフロキサシン、およびレボフロキサシンの MIC の増加 (表 3)、および RND 型多剤排出トランスポーター MexXY-OprM の構成要素である mexX の発現の増加を示しました (図 1C)。 2 種類のシプロフロキサシン耐性変異体が得られました。1 つ (CIP131) は、DNA ジャイレースのサブユニットである GyrA の変異のみにより、フルオロキノロン類 (シプロフロキサシンおよびレボフロキサシン) に対する MIC の増加を示しました (表 3、5)。もう一方 (CIP101 および CIP126) は、フルオロキノロンだけでなく、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、エリスロマイシン、およびアクリフラビンに対しても耐性を示しました。これらの薬剤は、RND 型多剤排出トランスポーター MexCD-OprJ を介して輸出されることが以前に報告されており 4,12、mexCD-oprJ の発現の上昇が観察されました (図 1B)。 2 つの CIP 変異型を次のステップで親株として使用しました。変異体は 8 つの異なる薬物配列に曝露されました。

変異体の入手の流れ。 PAO1を親株として使用して、ゲンタマイシン、イミペネム、およびシプロフロキサシンの耐性変異体が最初に得られました。その中から代表的な菌株を選択し、第２の抗菌剤を曝露して耐性変異株を取得した。同様に、3 番目の抗菌剤を曝露して 3 つの薬剤耐性変異体を得ました。

OprD のウエスタンブロット分析。 1: PAO1、2: IPM429、3: GI4401、4: CI4401、5: CgI4401、6: GCI48410、7: CGI44201、8: CgGI44405。化学発光処理後、ゲルイメージングシステムを使用してブロットを視覚化しました。ここでは必要なレーンのみを示しています。トリミング前の生データは補足データに示されています。

GI 変異体は、4 μg/mL のイミペネムに曝露された GM458 から単離されました。 5 つの変異体は、イミペネムに対してのみ MIC の増加 (8 ～ 32 倍) を示しました (表 3 および S1)。代表的な GI4401 では、OprD タンパク質は膜画分に検出されませんでした (図 3)。この株では、oprD コード領域で 1 ヌクレオチドの欠失が観察され、フレームシフト変異が発生しました (表 4)。シプロフロキサシン耐性変異体は、2μg/mlのシプロフロキサシンに曝露されたGI4401から単離された。シプロフロキサシンおよびレボフロキサシンのMICは、ランダムに選択した10個の変異体で増加しました(それぞれ4〜16倍および8〜16倍)(表3およびS1)。 10 個の変異体すべてが MDRP の基準を満たしていました。 GIC44805 を除いて、gyrA または gyrB のキノロン耐性決定領域 (QRDR) の変異が同定されました。 (表5)。

我々は、2μg/mlのシプロフロキサシンに曝露したGM458からシプロフロキサシン耐性変異体（GC変異体）を単離した。変異体のうち 10 個は、シプロフロキサシンおよびレボフロキサシンに対して MIC の増加を示しましたが、他の薬物に対しては増加しませんでした (表 3 および S2)。この結果は、これらの変異体が DNA ジャイレース変異体であるが、MexCD-OprJ 上方制御される変異体ではないことを示しました。すべての突然変異体は、gyrA の QRDR に突然変異を持っていました (表 5)。イミペネム耐性変異体 (GCI 変異体) は、4 μg/mL のイミペネムに曝露された GC4801 から単離されました。 10 個の GCI 変異体すべてがイミペネムに対する耐性の増加を示しました (GC4801 の 16 ～ 32 倍の増加) (表 3)。 GCI48410では、oprDに挿入変異が観察され、その結果フレームシフト変異が生じ(表4)、外膜画分ではOprDタンパク質が検出されなかった(図3)。 10 個の GCI 変異体すべてが MDRP の基準を満たしていました (表 S2)。

シプロフロキサシン耐性変異体（IC 変異体）は、IPM429 を 1 μg/ml シプロフロキサシンに曝露することによって単離されました。 10 個の IC 変異体は、フルオロキノロンだけでなく、クロラムフェニコール、エリスロマイシン、およびアクリフラビンに対しても MIC の増加を示しました (表 3 および S3)。 mexCD-oprJ のアップレギュレーションが発生したようです。 10 個の変異体のうち 6 個では、カルベニシリン、イミペネム、ゲンタマイシン、およびアミカシンの MIC が減少しました (表 S3)。同様の現象が nfxB 変異体でも報告されています 13,14。 mexC の mRNA レベルは IC4430 で増加しましたが、カルベニシリン、イミペネム、ゲンタマイシン、アミカシンの MIC は変化しませんでした。 IC4404 では、カルベニシリン、イミペネム、ゲンタマイシン、アミカシンの MIC が減少しました (図 1B)。 IC4430を使用して、16μg/mlのゲンタマイシンに曝露することによりゲンタマイシン耐性変異体(ICG変異体)を単離した。 10 個の ICG 変異体すべてがゲンタマイシンおよびアミカシンに対して MIC の大幅な増加を示しましたが、9 個ではイミペネム、シプロフロキサシン、レボフロキサシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、およびエリスロマイシンに対して MIC の減少が示されました (表 3 および S3)。イミペネム、シプロフロキサシン、レボフロキサシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、エリスロマイシンに対するMICを維持したICG444391では、mexXがICG444391で高度に発現していた（図1D）。 ICG444391 のみが MDRP の基準を満たしていました。

ゲンタマイシン耐性変異体（IG変異体）は、16μg/mlのゲンタマイシンに曝露されたIPM429から単離された。 10 個の変異体は、ゲンタマイシンおよびアミカシンに対する耐性の増加 (それぞれ 8 ～ 16 倍および 4 ～ 8 倍) を示しました (表 3 および S4)。これらの薬剤耐性パターンは、mexXY の発現が上方制御されていることを示しました。しかし、3 つの変異体 (IG4405、IG4427、および IG4485) は、抗生物質を含まない培養液で継代すると、容易に親株の発現レベルに戻ることがわかりました。その後の分析のために、安定した耐性を示す IG4455 を選択しました。 IG4455では、mexXの発現が上方制御されていました（図1D）。シプロフロキサシン耐性変異体（IGC変異体）を、2μg/mlのシプロフロキサシンに曝露したIG4455から単離した。 10 個の変異体がシプロフロキサシンおよびレボフロキサシンに対する耐性の増加を示し (表 S4)、すべての変異体の QRDR (Ser466Phe) で GyrB 変異が同定されました (表 5)。

mexC の上方制御された発現が CIP101 で観察されました (図 1B)。ゲンタマイシン耐性変異体（CG 変異体）は、16 μg/ml のゲンタマイシンへの曝露後に単離されました。 10 個の変異体は、ゲンタマイシンおよびアミカシンの MIC の増加 (8 ～ 64 倍) を示しました (表 3 および S5)。 CG4401 では、mexX の発現が上方制御されました (図 1D)。イミペネム耐性変異体（CGI変異体）は、2μg/mlのイミペネムを含むCG4401から単離され、10個の変異体がイミペネムのみについてMICの増加（8〜16倍）を示した（表3およびS5）。 CGI44201の膜画分ではOprDタンパク質は検出されなかった(図3)。 oprD コード領域で大きな欠失が確認されました (表 4)。イミペネムの MIC が 16 μg/ml 未満であったため、10 個の CGI 変異体すべてが非 MDRP として定義されました。

我々は、2μg/mlのイミペネムに曝露したCIP101からイミペネム耐性変異体（CI変異体）を単離しようと試みたが、理由は不明で失敗した。しかし、CI変異体は、4μg/mlのイミペネムに曝露されたmexCの発現が上方制御された変異体であるCIP126から単離された。 10 種類の CI 変異体すべてが、イミペネムに対して 16 倍高い MIC を示しました (表 3 および S6)。 OprD タンパク質は CI4401 の膜画分では検出されず (図 3)、ナンセンス変異は oprD コード領域で同定されました (表 4)。 16μg/mlのゲンタマイシンで単離されたCI4401からのゲンタマイシン耐性変異体(CIG変異体)は、ゲンタマイシンおよびアミカシンに対する耐性の増加を示した(表3およびS6)。これらの変異体の 1 つである CIG44408 は、mexX の発現の増加を示しました (図 1E)。 10 個の CIG 変異体のうち 3 個 (CIG44402、CIG44404、および CIG44408) が MDRP として分類されました。

CIP131 はシプロフロキサシンおよびレボフロキサシンに対する耐性の増加を示し、これはそれが DNA ジャイレース変異体であることを示しました。我々は、GyrA の QRDR に点突然変異 (Thr83Ile) を同定しました (表 5)。 16 μg/ml のゲンタマイシンを使用して、ゲンタマイシン耐性変異体 (CgG 変異体) を単離しました。 9 つの CgG 変異体は、ゲンタマイシン、アミカシン、シプロフロキサシン、およびレボフロキサシンについて CIP131 よりも高い MIC を示しました (表 3 および S7)。 mexX の上方制御された発現が CgG4479 で観察されました (図 1D)。イミペネム耐性変異体（CgGI変異体）を、4μg/mlのイミペネムに曝露したCgG4479から単離した。 10 個の CgGI 変異体すべてが、イミペネムに対してのみ 8 ～ 16 倍高い MIC を示しました (表 3 および S7)。 10 個の変異体のうち 5 個が MDRP として認識されました。フレームシフト突然変異をもたらす oprD の 1 つのヌクレオチド欠失が CgGI44405 で同定されましたが (表 4)、一方、OprD タンパク質は外膜画分では検出されませんでした (図 3)。

ＣＩＰ１３１からのイミペネム耐性変異体（ＣｇＩ変異体）を、４μｇ／ｍｌのイミペネムを用いて単離した。 10 個の CgI 変異体すべてがイミペネムのみに対して耐性の増加を示し (表 3 および S8)、CgI4401 の oprD で 1 ヌクレオチドの欠失 (およびフレームシフト変異) が同定されました (表 4)。 OprD タンパク質は免疫ブロッティング分析では検出されませんでした (図 3)。ゲンタマイシン耐性変異体（CgIG変異体）を16μg/mlのゲンタマイシンを用いて単離した。これらの変異体は、ゲンタマイシン、アミカシン、シプロフロキサシン、およびレボフロキサシンのMICの増加を示しました（表3およびS8）。 CgIG44441では、mexXのより高い発現が観察されました（図1D）。 8 つの変異体が MDRP として分類されました。

シプロフロキサシン、ゲンタマイシン、イミペネムのMICに基づくMDRPの出現率を検討した。 GCI、GIC、IGC 変異体の場合、すべての変異体は MDRP として分類されました。１０個のＣｇＧＩ変異体のうち５個はイミペネムに対して８μｇ／ｍｌのＭＩＣを示し、残りの５個は１６μｇ／ｍｌを示した。この差はわずか 2 倍であるため、無視できるものと考えられました。 GCI、GIC、IGC、CgGIの順にMDRPの出現率が増加しました。

MDRP は CGI 変異体には含まれませんでした。 ICG、CIG、および CgIG 変異体の中には、MDRP 株も含まれていました。しかし、多くの MDRP はゲンタマイシンに対して不安定な耐性を示しました。最初は 1 つと 3 つの MDRP が、それぞれ ICG と CIG 変異体に含まれていました。しかし、ゲンタマイシンに対する耐性は継代後に消失しました。 CgIG では、8 つの分離株が当初 MDRP 表現型を示しましたが、7 株は不安定な MDRP でした。

我々はここで、MDRPの出現に寄与するメカニズムを解明することを試みた。予想通り、1 種類の薬剤のみに曝露した後では MDRP を分離できませんでした。また、これまでのところ、3 つの薬物への同時曝露後に MDRP は分離されていません。各薬剤の変異体の出現頻度を 10-8 とすると、三重耐性の頻度は 10-24 となります。この確率はゼロではありませんが、実験室や臨床現場で達成することはほぼ不可能です。一方、MDRP は各薬物への連続曝露後に得られました。多くの臨床医や薬剤師が報告しているように、異なる種類の薬剤を連続して使用すると、MDRP の出現が促進され、リスクが高くなります。

薬物曝露の順序は MDRP の出現に影響を与えました。シプロフロキサシンの前にゲンタマイシンに曝露すると、MDRP の出現率が高くなりました。この結果は、シプロフロキサシン耐性の根底にあるメカニズムがMDRPの出現率に関連していることを示しました。シプロフロキサシンへの最初の曝露後、シプロフロキサシンとレボフロキサシンに加えて、クロラムフェニコール、エリスロマイシン、アクリフラビンの MIC が増加しました。このような抵抗パターンは、MexCD-OprJ の輸送基質と一致しました。 RT-PCRによって明らかになったように(図1B)、mexC発現はCIP126において有意に増加した。同様の現象が、IPM429 の IC 変異体でも観察されました。これらの結果は、mexXY の発現が上方制御される前に、シプロフロキサシンに曝露された細胞における mexC の発現が増加することを示しました。一方、ゲンタマイシンに曝露されたシプロフロキサシン処理細胞では、mexXY の発現がすでに上方制御されており、すべての変異体 (GC、IGC、および GIC 変異体) で DNA ジャイレースの変異が検出されました。したがって、抗菌剤への曝露の順序は、耐性機構、つまりジャイレース変異または mexCD-oprJ の高発現に影響を及ぼし、特定の順序で安定した MDRP が出現する可能性があります。

緑膿菌におけるアミノグリコシド耐性のメカニズムは、修飾酵素による不活化、リボソームの変異、mexXY15 の過剰発現など、これまでにいくつか報告されています。本研究では、多くの変異体が mexXY の過剰発現を示しました。さらに、mexXY の過剰発現に関連する変異が報告されています 7、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26。変異体におけるゲンタマイシン耐性に関するヌクレオチドの変化はまだ特定されていませんが、MDRP の頻度について重要な洞察が得られる可能性があります。

不安定なゲンタマイシン耐性変異体も、ゲンタマイシン変異体の単離の各段階で一定の頻度で単離されました。これは一種の「適応抵抗」である可能性があります27。私たちの実験では、安定したゲンタマイシン変異体が第 2 ステップまたは第 3 ステップで選択されました。第 3 ステップでは、安定したゲンタマイシン変異体はほとんど分離されませんでした。したがって、ゲンタマイシン耐性の安定性も MDRP の発生率に寄与する重要な要因である可能性があります。

外来遺伝子の獲得は、臨床現場での MDRP の出現メカニズムとして重要である可能性があります。ゲンタマイシン耐性の修飾酵素とイミペネム耐性のメタロ β-ラクタマーゼを考慮する必要があります。外因性遺伝子の獲得は実験室では起こり得ないため、今回の結果は臨床現場での MDRP 出現の根底にあるメカニズムを直接反映していない可能性があります。しかし、得られた結果は、MDRP 発症の危険因子は、(1) 安定したゲンタマイシン耐性、および (2) シプロフロキサシンよりも前のゲンタマイシンへの曝露であることを示しました。外因性ゲンタマイシン耐性遺伝子を組み込むことによって安定したゲンタマイシン耐性を発現した菌株による感染症の治療にシプロフロキサシンが処方された場合、MDRP の頻度が著しく増加する可能性があります。臨床現場における外因性ゲンタマイシン耐性遺伝子の蔓延を明らかにすることで、MDRP の出現の全体像が得られる可能性があります。

MDRP の出現率は曝露の順序に応じて変化することを示しました。シプロフロキサシンの前にゲンタマイシンを適用した場合、MDRP がより頻繁に出現しましたが、シプロフロキサシンを最初に適用した場合にはほとんど分離されませんでした。また、シプロフロキサシンに続いてゲンタマイシンに曝露すると、NfxB 変異により、RND 型多剤排出ポンプである MexCD-OprJ の発現が増加しました。対照的に、ゲンタマイシンに続いてシプロフロキサシンに曝露すると、DNA ジャイレースにさらに多くの変異が生じました。これらの結果は、キノロン耐性メカニズムのタイプが MDRP の頻度に関連しており、MDRP 発生のリスクがゲンタマイシンとシプロフロキサシンへの曝露の順序に大きく依存していることを示唆しています。

緑膿菌 PAO1 または変異体の細胞 (107 ～ 109 CFU) を L 培地 (1.0% ポリペプトン、0.5% 酵母抽出物、および 0.5% NaCl、pH 7.0) で増殖させ、L 寒天プレート (1.0% ポリペプトン、0.5% ポリペプトン) 上に広げました。酵母エキス、0.5% NaCl、および 1.5% 寒天、pH 7.0) には、カルベニシリン、イミペネム、アミカシン、ゲンタマイシン、シプロフロキサシン、レボフロキサシン、およびエリスロマイシンの 7 つの抗菌剤のいずれかについて 1 × 、2 × 、4 × MIC が含まれています。 37℃で24〜36時間インキュベートした後、プレート上に出現した多くのコロニーが得られました。単一コロニーを単離した後、変異体の薬剤耐性パターンを調査しました。アミカシン（和光市、カタログ番号014-24941）、カルベニシリン（和光市、カタログ番号037-23693）、シプロフロキサシン（和光市、カタログ番号032-18731）、ゲンタマイシン（和光市、カタログ番号079-02973）、イミペネム（和光市、カタログ番号037-23693） 098-07283）、レボフロキサシン（Fluka、カタログ番号 28266）は、指定された製造業者から購入しました。

さまざまな薬物の最小発育阻止濃度 (MIC) は、CLSI 勧告 (CLSI、2006) に従って、Muller-Hinton ブロス (Difco) 中で 2 倍希釈法により評価されました。試験培地の細胞 (105 細胞 ml-1) を 37 °C で 24 時間インキュベートし、その後増殖を測定しました。

RNAの調製と逆転写PCRは、製造業者のプロトコールに従って実行されました。簡単に言うと、RNeasy Mini Kit (Qiagen) を使用して、OD650 が 0.7 になるまで増殖させた細胞から全細菌 RNA を単離しました。残留DNAはRNase-Free DNase (Promega)で処理することにより除去した。 1 ナノグラムの DNase 処理 RNA を、Qiagen OneStep RT-PCR キット (Qiagen) を使用した 1 回の反応のテンプレートとして使用しました。 mRNAを検出するためのプライマーペアを表S9に示します。 rpsL遺伝子の発現を内部対照として使用した。 PCR サイクルは、mexA については 27、mexC については 33、mexX については 32、および rpsL については 24 でした。 3% アガロースゲル (Nippongene) 電気泳動を使用して生成物を分離し、臭化エチジウムで視覚化しました。

OprD の調製は、わずかに変更を加えた前述の方法によって実行されました 28。緑膿菌細胞を対数増殖期中期 (OD650 = 0.7) まで増殖させ、回収し、50 mM Tris-HCl (pH7.4) + 5 mM MgSO4 に懸濁しました。細胞は超音波処理器 Vibra cell VC505 で破壊されました。壊れていない細胞を除去し、超遠心分離 (100,000 × g) で膜画分を調製しました。ペレットを２回洗浄し、同じ緩衝液で溶解した。 SDS ポリアクリルアミドゲル電気泳動は、前述のとおり 29、サンプルあたり 40 μg で実行されました。タンパク質をニトロセルロースメンブレンフィルター（ADVANTEC TOYO）に移した。ウサギ抗 OprD 抗体は、Meiji Seika ファルマ社のご厚意により提供していただきました。30。ヤギ抗ウサギ IgG 抗体 (Bioss Inc、カタログ bs-0295G-HRP) を 2 次抗体として使用し、ECL システム (Amersham Pharmacia Biotech) を使用して OprD を検出しました。

現在の研究中に使用および/または分析されたデータセットは、合理的な要求に応じて責任著者から入手できます。

Hwang, W. & Yoon、SS 多剤耐性緑膿菌における毒性特性と抗生物質耐性の作用機序。科学。議員9、487。https://doi.org/10.1038/s41598-018-37422-9 (2019)。

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ラマナタン、B.ら。次世代配列決定により、緑膿菌のゲノム内の抗生物質耐性変異体が明らかになりました。 PLoS ONE 12、e0182524。 https://doi.org/10.1371/journal.pone.0182524 (2017)。