一般制御非抑制性 1 はカチオン性アミノ酸トランスポーター 1 と相互作用し、ネッタイシマカの繁殖力に影響を与えます

May 04, 2023

寄生虫とベクター 15 巻、記事番号: 383 (2022) この記事を引用

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アミノ酸輸送タンパク質であるカチオン性アミノ酸輸送体 1 (CAT1) は、蚊の脂肪体の栄養センサーの一部です。カチオン性アミノ酸輸送体の SLC7 ファミリーのメンバーであり、吸血後の蚊の血リンパ中のアミノ酸レベルの上昇とその後の脂肪体における遺伝子発現の変化を検出するのに最も重要です。

我々はネッタイシマカのカチオン性アミノ酸トランスポーター（CAT）の再アノテーションを実行し、CAT1のC末端尾部を選択して酵母ツーハイブリッドスクリーニングを実行して、このタンパク質の推定上の相互作用物質を同定した。私たちが同定した興味深い相互作用タンパク質の 1 つは、General Control Nonderepressible 1 (GCN1) でした。我々は、qRT-PCR およびウェスタンブロットを使用して、いくつかの成人の臓器および構造における GCN1 の発現パターンを決定しました。最後に、二本鎖 RNA を使用して GCN1 をノックダウンし、下流のシグナル伝達中間体の変化と卵黄形成および繁殖力に対するノックダウンの影響を特定しました。

Aeの画面内。ネッタイシマカ CAT1 相互作用タンパク質、推定上の相互作用物質として GCN1 を同定しました。 GCN1 は蚊の卵巣と脂肪体で高度に発現しています。我々は、真核生物の翻訳開始因子2サブユニットα（eIF2α）のリン酸化が卵黄形成中に変化すること、および蚊全体におけるGCN1のRNA干渉ノックダウンにより、対照と比較して処理された蚊の抱卵サイズが減少するという証拠を提供する。

ネッタイシマカ CAT1 と GCN1 は相互作用するパートナーである可能性が高く、GCN1 は卵の適切な発育に必要である可能性があります。我々のデータは、GCN1が卵黄形成に関与するさまざまな蚊組織の栄養センサー機構の一部であることを示唆しています。

栄養素を感知し、栄養素レベルの変化を追跡する能力は、多細胞生物の細胞の機能と生存、さらには恒常性の維持にとって最も重要です。真核細胞は、特定の栄養素濃度とエネルギー状態を追跡するために、さまざまなセンシングおよびシグナル伝達経路を使用します [1]。アミノ酸は、生存と成長に必要な機能を実行するために細胞が生成するすべてのタンパク質の構成要素です。真核生物では 2 つの保存されたアミノ酸感知経路が同定されています。(i) ラパマイシンの機構的標的 (mTOR) 複合体 1 (mTORC1) シグナル伝達経路。 (ii) 一般アミノ酸制御 (GAAC) 経路。これは酵母で最初に記載され、哺乳類ではアミノ酸応答 (AAR) 経路と呼ばれることもあります [2、3、4]。どちらの経路も細胞の遊離アミノ酸含有量に応じて新しいタンパク質の合成を調節し、mTORC1 経路は成長因子からの入力、エネルギー状態、栄養素の利用可能性を統合して細胞増殖を調節することが知られています[2、3、4、5]。

mTORC1の活性化は、リソソーム膜への複合体の動員によって達成され、そこでリソソームの遊離アミノ酸含有量を感知するか、または他の細胞質アミノ酸代謝遺伝子と相互作用することが提案されている[2、3、4]。活性化されると、mTORC1 の TOR キナーゼは別のキナーゼであるリボソームタンパク質 S6 キナーゼベータ-1 (p70-S6K) をリン酸化し、次にリボソームタンパク質 S6 をリン酸化して、タンパク質合成を「オン」にします [3、4、6]。 GAAC 経路の中心的なキナーゼは、General Control Nonderepressible (GCN) 2 (GCN2) であり、低細胞内アミノ酸レベルを含むいくつかの細胞ストレッサーに応答して活性化されます [7、8、9、10、11]。 GCN2は、別のタンパク質であるGeneral Control Nonderepressible 1（GCN1）の助けを借りてこれらのレベルを感知します。GCN2は、GCN2、General Control Nonderepressible 20（GCN20）およびリボソームを含むいくつかのタンパク質と複合体を形成し、GCN2が非荷電転移RNA（tRNA）を感知できるようにします。リボソーム A 部位で [12,13,14,15]、応答として真核生物の翻訳開始因子 2 サブユニットアルファ (eIF2α) をリン酸化します [12,13,14,15,16,17,18]。 eIF2αのリン酸化は一般的な翻訳の低下を引き起こし、アミノ酸飢餓状態に応答するGCN4（哺乳動物では転写因子4の活性化[転写因子4の活性化]）を含む遺伝子のサブセットの翻訳を増強する[19、20、21、22]。 ]。 mTORC1 と GCN2 シグナル伝達経路の間でどの程度のクロストークが発生するかを理解する取り組みが進行中です [23、24、25、26]。

雌の黄熱病蚊 (ネッタイシマカ) は、さまざまな臓器や組織で活動するアミノ酸シグナル伝達経路を研究するための優れたモデル系です [27、28]。この種のメスの蚊は、産卵に必要な栄養素を得るために血粉を必要とします。血液が中腸に摂取されると、栄養素、特に消化された血液タンパク質からのアミノ酸が体リンパに分泌され、そこから脂肪体に取り込まれ、卵黄前駆体タンパク質（YPP）の生成に利用されます。 YPP は脂肪体で処理され、血リンパに分泌され、受容体媒介エンドサイトーシスを介して発生中の卵母細胞に吸収されます。卵における卵黄形成の重要なプロセスは、卵黄形成と呼ばれます[29]。

脂肪体によるアミノ酸の取り込みは卵黄形成の開始に不可欠であり、YPP の発現にはカチオン性アミノ酸が絶対に必要です [30、31]。卵黄形成中の脂肪体へのカチオン性アミノ酸の輸送は、ヘテロ二量体アミノ酸トランスポーター (HAT) およびカチオン性アミノ酸トランスポーター (CAT) を含む溶質キャリアファミリー 7 (SLC7) のタンパク質によって促進されます [32]。 CAT タンパク質は 14 回膜貫通ドメインのトランセプター、つまり受容体としても機能すると考えられているトランスポーター [33]、その基質特異性は 4 番目の細胞内ループから次の 2 つの膜貫通ドメイン (ドメイン IX) までにわたる 80 アミノ酸領域によって決定されます。および X) [34]。 CAT は、Ae において重要な役割を果たすことが示されています。 RNA 干渉 (RNAi) ノックダウンによって実証された、卵黄形成中のネッタイシマカ YPP 合成 [32]。 5 つの CAT タンパク質が Ae に分類されています。ネッタイシマカ [32]、これらのうち 2 つの基質特異性と輸送動態が特徴付けられています [30、35、36]。ネッタイシマカ CAT 1 (AaCAT1) は選択的にヒスチジンを輸送します [36]。ネッタイシマカ CAT 3 (AaCAT3) は、より一般的なカチオン性アミノ酸トランセプターとして機能し、アルギニンに対してわずかな優先性を示します [35]。残りの AaCAT の基質プロファイルは分類されていません。

CAT ファミリーのメンバーは、mTOR シグナル伝達経路の一部であることが以前に示されています。 AeのRNAiノックダウン。ネッタイシマカ CAT 2 (AaCAT2) および AaCAT3 は、培養脂肪体をアミノ酸で刺激した後、リン酸化 p70-S6K の量を大幅に減少させました [32]。一方、Ae の脂肪体における CAT を介したアミノ酸の取り込みと YPP 遺伝子発現の mTOR 制御との間の関連性。ネッタイシマカはしっかりと確立されていますが、CAT と mTOR 栄養素センサーの間のシグナル伝達媒介物はまだ実験的に確立されていません。

今回我々は、AaCAT1がAeのGCN1と相互作用するという証拠を提示する。ネッタイシマカ、そしてその GCN1 ノックダウンは栄養シグナル伝達と蚊の卵母細胞の発育に影響を与えます。

すべての実験にはネッタイシマカ (リバプール株) 蚊を使用しました。卵は、13 × 20 インチの中で孵化する前に少なくとも 1 週間乾燥させました。パン、27 °C の脱イオン水中で。幼虫には 3 日おきに Special Kitty ドライキャットフードペレット (米国アーカンソー州ベントンビルの Walmart Stores Inc.) を与え、各パン内の水を 5 日ごとに交換しました。蛹を皿に分けて Bug Dorm-1 昆虫飼育ケージ (30 × 30 × 30 cm、Bugdorm、台中、台湾) に保管し、羽化させました。成虫は制御された条件（27℃、湿度80％、14：10時間の明暗サイクル）下でBug Dormケージ内で維持され、20％スクロース溶液を自由に与えられた。羽化後 5 ～ 7 日の成体メスをすべての実験に使用しました。

ネッタイシマカ CAT タンパク質配列は、以前の出版物 [32] および国立バイオテクノロジー情報センター (NCBI) タンパク質データベースからアクセスしました。キイロショウジョウバエのタンパク質配列は、FlyBase バージョン FB2021_04 からアクセスしました [37]。全部Aぇ。ネッタイシマカとキイロショウジョウバエのタンパク質配列は、デフォルト設定を使用して分子進化遺伝学解析 (MEGA) ソフトウェアバージョン 11 [38] を使用して整列され、MEGA 11 のデフォルト設定を使用して隣接結合ツリーが構築されました。転写バリアントまたは相同配列を含むノード折りたたまれ、関連する注釈情報が手動でツリーに追加されました。

血を吸った100匹の雌成虫の羽、脚、頭を取り除いて廃棄した。残りの組織を、0.5 mlのTRIzol（登録商標）試薬（Thermo Fisher Scientific、Waltham、MA、USA）とともに2 mlのエッペンドルフチューブに入れた。組織は、使い捨てポリブチレンテレフタレート乳棒 (VWR、Avantor、カタログ番号 4774-358) を備えた VWR コードレスモーター (VWR、Avantor、米国ペンシルベニア州ラドナー、カタログ番号 4774-370) を使用し、さらに 0.5 ml を使用して均質化しました。チューブを反転して混合する前に、ＴＲＩｚｏｌを加えた。 TRIzol:クロロホルムによるRNA単離プロトコールを使用して、全RNAを単離および沈殿させました。相分離後、total RNAを含む水相を分離し、水相に等量の100%エタノールを加えて混合した。次に、Zymo RNA Clean and Concentrator 100 キット (Zymo Research、米国カリフォルニア州アーバイン、カタログ番号 R1019) を使用してサンプルを精製し、インカラム DNase 処理を実行してゲノム DNA を除去しました。メッセンジャー RNA (mRNA) の濃縮は、Takara (Takara Bio USA Inc.、米国カリフォルニア州サンノゼ) のポリアデニル化 RNA の精製プロトコルを使用して実行されました。次いで、RNA濃度をNanodrop™ 1000分光光度計(Thermo Fisher Scientific)で測定した。

相補的 DNA (cDNA) ライブラリーは、Make Your Own "Mate & Plate" Library System (Takara Bio USA Inc.) を製造業者の指示に従って使用して構築しました。簡単に説明すると、精製 RNA サンプル 2 μl、オリゴマー化デオキシチミジン (オリゴ dT) プライマー溶液 (CDSIII) 1 μl、および脱イオン水 1 μl を 72 °C で 2 分間インキュベートし、スピンする前に氷上で 2 分間冷却しました。 14,000 gで10秒間軽く下げます。反応混合物を完成させるために、2.0 μl 5× First-Strand Buffer Solution、1.0 μl ジチオスレイトール (DTT; 100 mM)、1.0 μl デオキシリボヌクレオシド三リン酸 (NTP) ミックス (10 mM) および 1.0 μl SMART MMLV 逆転写酵素を溶液に加えました。。得られた反応混合物を 42 °C で 10 分間インキュベートした後、1 μl の SMART III 修飾オリゴ dT を添加しました。次に、溶液を混合し、42 °C で 1 時間インキュベートしました。反応混合物を75℃で10分間加熱して第一鎖合成を停止させ、その後室温まで冷却した。最後に、1 μl の RNase H を反応混合物に添加し、37 °C で 20 分間インキュベートしました。

cDNA ライブラリーは、Advantage 2 Polymerase Mix (Takara Bio USA Inc.) を使用した長距離 PCR 増幅によって生成されました。反応ミックスは、2 μl のファーストストランド cDNA、70 μl の脱イオン水、10 μl 10× Advantage 2 PCR バッファー、2 μl 50× dNTP ミックス、2 μl 5' PCR プライマー、2 μl 3' PCR プライマー、10 μl 10 で構成されていました。 × 融解溶液と 2 μl の 50× Advantage 2 ポリメラーゼミックス。増幅は、以下のサイクリングパラメータを適用する Eppendorf EPgradient MasterCycle (Eppendorf North America、Enfield、CT、USA) で実行されました。次に、95 °C で 10 秒間と 68 °C で 6 分間を 26 サイクル。最終サイクルは 68 °C で 5 分間。

Aeの膜トポロジー。ネッタイシマカ AaCAT1 タンパク質 (XP_021707900.1) は、ExPASy TMHMM v2.0 膜貫通予測ツール [39] および Protter 膜貫通予測ツール [40] を使用して予測され、N 末端、C 末端および細胞内領域が同定されました。 NCBI BLAST プログラム [41] の TBLASTN 機能を使用して、Ae の C 末端細胞内配列のヌクレオチド配列を同定しました。ネッタイシマカのコドンの使用法。 C 末端細胞内配列に隣接するプライマーは、NCBI Primer-BLAST [42] を使用して設計され、NetPrimer (http://www.premierbiosoft.com/netprimer/) で交差検証されました。 Matchmaker Gold Yeast Two-Hybrid Kit (Takara Bio USA Inc.) で指定されているようにアダプター配列をフォワードプライマーとリバースプライマーの末端に追加して、Matchmaker Gold Yeast で使用するための pGBKT7 ベイトプラスミドへのベイトフラグメントの挿入を確実にしました。ツーハイブリッドキット。完全なプライマー配列 (アダプター領域は斜体で示されています) は次のとおりです。前方 - 5'-CATGGAGGCCGAATTCCATTCGGTTCTTGGCTCCGGTAGT-3'。逆方向 - 5'-GCAGGTCGACGGATCCTACGCCTTTTCGAGTCCTACCATG-3'。

AaCAT1ベイトフラグメントを生成するためのPCRを、Eppendorf EPgradient Mastercycler (Eppendorf North America)を使用して実施し、ツーハイブリッドスクリーニング用のベイトフラグメントを生成した。ベイトプライマーは、前のステップで生成された cDNA ライブラリーを鋳型として反応させる際に使用されました。 In-Fusion HD Cloning Kit (Takara Bio USA Inc.) を使用して、短いフラグメントと長いフラグメントを pGBKT7 プラスミドベクターにクローニングしました。次に、Yeastmaker Yeast Transformation System 2 キット (Takara Bio USA Inc.) を使用して、製造者の指示に従って、ベイトプラスミドを Y2HGold 株のコンピテント酵母細胞に形質転換しました。

まず、Yeastmaker Yeast Transformation System 2 (Takara Bio USA Inc.) における酵母形質転換プロトコールに従って、YI87 株のコンピテント酵母細胞を調製した。次に、Make Your Own "Mate & Plate" Library System (Takara Bio USA Inc.) を使用して、製造業者の指示に従ってツーハイブリッドライブラリーの構築を完了しました。

Matchmaker Gold Yeast Two-Hybrid System (Takara Bio USA Inc.) を使用して、製造者の指示に従って餌 (Y2HGold) と餌 (Y187) の酵母菌株を交配させました。次に、交配した酵母を、オーレオバシジンとα-ガラクトシダーゼ酵素の発色基質であるX-α-Galを添加したロイシンとトリプトファンを欠く合成合成（SD）増殖培地（ダブルドロップアウト[DDO]培地）に播種しました。

潜在的な偽陽性を選別するために、青色のコロニーを選択し、アデニンとヒスチジンを欠く新鮮な DDO (四重ドロップアウト [QDO] 培地) にパッチしました。パッチを適用したコロニーを QDO 培地で 3 日間増殖させた後、青色コロニーの別の選択を行いました。酵母は複数の異なるプラスミドを保有している可能性があるため、QDO 培地での増殖後に青色コロニーが保有する可能性のある相互作用しないプレイプラスミドを選択する必要がありました。これを行うために、QDO 培地から青いコロニーを選択し、新鮮な DDO 培地にパッチしました。コロニーを新鮮な DDO 培地に 2 回パッチし、この選択の最後にある青色のコロニーのみを相互作用の可能性を分析するために保持しました。

DDO で 2 ラウンドの選択を行った後、残りの青色コロニーのプレイインサート組成を、Matchmaker Insert Check PCR Mix 2 (Takara Bio USA Inc.) を使用したコロニー PCR によってチェックしました。 PCR 産物は、1% トリス酢酸エチレンジアミン四酢酸 (EDTA) 緩衝液 (TAE) アガロース/SYBR Safe ゲルでの電気泳動によって分析されました。複数のバンドの出現は、細胞内に複数のプレイプラスミドが存在することを示しています。単一のバンドを生成した PCR 産物は精製され、配列決定のために Molecular Cloning Laboratories (MCLAB) に送られました。 NCBI BLAST [43] を使用して Ae を特定しました。プレイプラスミド配列データに対応するネッタイシマカ遺伝子配列。既知の蚊挿入物を持たないプラスミドを含むコロニーなどの明らかな偽陽性を除去することによって、このデータセットから推定 AaCAT1 インタラクターのセットが選択され、これら 2 つの位置が領域を表すため、サイトゾルおよび原形質膜に局在することが知られているインタラクターが選択されました。ここで、タンパク質は AaCAT1 と相互作用する可能性が最も高くなります。

本明細書に記載の実験における蚊からのタンパク質の単離は次のように実施した。脚、頭、羽を蚊から取り除き、結果に記載されている各アッセイに必要な構造を解剖しました。解剖した臓器と構造を、使い捨てポリブチレンテレフタレート乳棒 (VWR、Avantor、カタログ番号 4774-358) を備えた VWR コードレスモーター (VWR、Avantor、カタログ番号 4774-370) を使用して、100 μl の溶解バッファー (50%) 中でホモジナイズしました。 mM Tris、pH 7.4、1% オクチルフェノキシポリ(エチレンオキシ) エタノール、分岐 [IGEPAL]、0.25% デオキシコール酸ナトリウム、150 mM NaCl、1 mM EDTA) に HALT™ プロテアーゼ阻害剤カクテルおよび HALT™ ホスファターゼ阻害剤カクテルをそれぞれ 1 μl 添加(どちらもサーモフィッシャーサイエンティフィック社製)。均質化したサンプルを 12,700 RPM、4 °C で 10 分間遠心分離して破片をペレット化しました。タンパク質を含む上清を収集し、タンパク質 BCA プログラムを使用して NanoDrop™ 1000 分光光度計 (Thermo Fisher Scientific) 上の Pierce™ BCA タンパク質アッセイキット (Thermo Fisher Scientific) でタンパク質濃度を測定しました。

6-ヒスチジン (6-His) タグ付き AaCAT1 C 末端ベイトフラグメント ([NH2]HHHHHHHSVLGSGSQTLSESQLENPFCMVGLEKA[COOH]) をカスタム合成し (Pierce Biotechnology、Thermo Fisher Scientific)、Pierce™ Pull-Down PolyHis Protein と組み合わせて使用しました。 :タンパク質相互作用キット (Pierce Biotechnology、Thermo Scientific) にいくつかの変更を加えたもの。

プルダウンの前に、タンパク質サンプルのセットを 6-His タグ付き AaCAT1 ベイトに架橋しました。簡単に説明すると、1 mg のジスクシンイミジルスルホキシド (DSSO) 架橋剤を 51.5 μl のジメチルスルホキシド (DMSO) に溶解して、50 mM ストックを作成しました。次に、脂肪体から分離した総タンパク質約 800 μg を、トリス緩衝生理食塩水 (TBS) 中で 200 μg/ml の濃度で 6-His タグ付き CAT1 C 末端と混合して、2 つの脂肪体サンプルを生成しました。溶解した架橋剤の 50 μl アリコートを 1 つの脂肪体サンプルに添加し、対照として 50 μl DMSO を非架橋脂肪体に添加しました。プルダウン反応で使用する前に、サンプルを 4 °C で一晩インキュベートして架橋を促進しました。タンパク質プルダウンの場合、サンプルあたり 500 μl His-Pur コバルト樹脂を 700 g、室温で 2 分間遠心分離し、上清を樹脂ベッドから除去しました。次に、樹脂を 500 μl の洗浄バッファー (TBS:Pierce Lysis バッファーと 5 mM イミダゾールの 1:1 混合物) で平衡化し、上記と同じ設定を使用して遠心分離しました。洗浄バッファーを除去し、タンパク質サンプルを樹脂に加え、室温で穏やかに揺り動かしながら 1 時間混合して、架橋 6-His タグ付きタンパク質の His-Pur 樹脂ビーズへの結合を促進しました。混合後、サンプルを上記のように遠心分離し、上清を収集して保持しました。ビーズを毎回200μlの洗浄緩衝液で3回洗浄し、各洗浄後にサンプルを上記のように遠心分離し、毎回上清を収集して保持した。最後に、結合タンパク質を100μlの溶出緩衝液(290mMイミダゾールを含む洗浄緩衝液)中で溶出した。ビーズを溶出緩衝液に再懸濁した後、サンプルを上記のように遠心分離し、上清を収集した。

タンパク質サンプルの 2 番目のセットは、架橋せずにプルダウンされました。簡単に説明すると、3 本の 1.7 ml エッペンドルフチューブ (ベイトのみのコントロール、樹脂コントロール、およびプルダウン) にそれぞれ 200 μl の HisPure コバルト樹脂を充填し、1.2 ml の洗浄液 (TBS: 1:1 混合) で 5 回洗浄して平衡化しました。 Pierce Lysis Buffer と 5 mM イミダゾール)。約 500 μg のベイトタンパク質をベイトのみのコントロールチューブとプルダウンチューブに加え、等量の洗浄溶液を樹脂コントロールチューブに加えました。 6-His タグ付きベイトペプチドの HisPure コバルト樹脂への結合を促進するために、すべてのチューブを 4 °C で穏やかに揺り動かしながら 2 時間インキュベートしました。インキュベーション後、上清を除去し、ビーズを400μlの洗浄溶液で1回洗浄した。約 2 mg の総タンパク質溶解物 (タンパク質抽出プロトコールについては上記を参照) を樹脂コントロールとプルダウンチューブの両方に加え、等量の洗浄溶液をベイトのみのコントロールチューブに加えました。固定化されたベイトタンパク質とプレイタンパク質間の相互作用を促進するために、すべてのチューブを 4 °C で穏やかに揺り動かしながら一晩インキュベートしました。翌日、ビーズを付属のスピンカラムに移し、遠心分離後に各サンプルからのフロースルーを収集しました。 290 mM イミダゾールを含む洗浄バッファー (250 μl) を各カラムに添加し、カラムを室温で 5 分間穏やかに揺り動かしながらインキュベートし、続いて遠心分離して溶出したタンパク質を回収しました。

Ae 用の T7 結合二本鎖 RNA (dsRNA) プライマー。ネッタイシマカ GCN1 は mRNA (GenBank 参照配列アクセッション: XM_001651776.2) から設計され、緑色蛍光タンパク質 (GFP) dsRNA プライマーは以前の研究から取得されました [44] (表 1)。合計Ae。ネッタイシマカ cDNA および GFP 含有プラスミド (3' EGFP pXOON) を鋳型として使用し、Megascript™ RNAi Kit (Thermo Fisher Scientific) を製造元の指示に従って使用して dsRNA 合成に使用するための T7 タグ付き dsDNA を生成しました。メス成虫の蚊に、引張ガラス毛細管を使用して約 1 μg/μl dsRNA 1 μl を経口投与し、胸腔内に注射し、20% スクロースを含む Bug Dorm-1 昆虫飼育ケージで 1 時間回復させました。 1 時間後、回復しなかった蚊はすべて廃棄されました。注射された生き残った蚊は、その後の実験で使用するまで、上記の飼育条件を使用して維持された。実施された他のすべての実験と蚊の年齢を標準化するために、すべての注射は羽化後 5 ～ 7 日目にメスに行われました。

総タンパク質は、各アッセイについてさまざまな器官または構造のプールから上記のように単離されました。全タンパク質を等量の 1:1 Laemmli 緩衝液:β-メルカプトエタノールと混合し、95 °C で 10 分間加熱してタンパク質を変性させました。サンプルを 7.5% ドデシル硫酸ナトリウム - ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (SDS-PAGE) ゲル (Bio-Rad Laboratories、米国カリフォルニア州ハーキュリーズ) にロードし、100 V で 90 分間 (GCN1) または 60 分間 (他のすべてのタンパク質) 実行しました。 ) PowerPac™ HC 電源 (Bio-Rad Laboratories) を使用してタンパク質を分離します。 Trans-Blot® Turbo™ Transfer System (Bio-Rad Laboratories) 内の事前に準備されたトランスファースタック (Bio-Rad Laboratories) を使用し、標準的な 30 分間のプリセットトランスファーを使用して、タンパク質をゲルからポリ二フッ化ビニリデン (PVDF) メンブレンに転写しました。走る。 PVDF メンブレンを 1× TBS + 0.05% Tween-20 (TBST) で 5 分間 3 回洗浄し、StartingBlock™ T20 (TBS) (Thermo Fisher Scientific) で穏やかに揺すりながら室温で 1 時間ブロックしました。メンブレンを、ブロッキングバッファーで希釈した一次抗体（表 2）と 4 °C で一晩穏やかに振盪しながらインキュベートし、続いて TBST で 5 分間ずつ 3 回洗浄し、次にブロッキングバッファーで希釈した適切な二次抗体（表 2）とインキュベートしました。穏やかに振盪しながら室温で1時間。次に、メンブレンを TBST で毎回 5 分間、5 回洗浄して遊離二次抗体を除去し、比色検出のために Pierce 1 ステップ TMB ブロッティング基質溶液 (Thermo Fisher Scientific) 中で室温で最大 30 分間インキュベートしました。優しい揺れ。あるいは、ブロットを Li-Cor WesternSure® PREMIUM Chemiluminescent Substrate (Li-Cor、リンカーン、ネブラスカ州、米国) 中で室温で 5 分間インキュベートし、その後、C-DiGit Blot Scanner (Li-Cor) を使用して染色膜を画像化しました。 Cor) および Image Studio™ ソフトウェア (Li-Cor)。ピクセル強度は、半定量濃度測定用のこのソフトウェアを使用して決定されました。

蚊の器官および構造を解剖し、Qiagen RNeasy Mini Kit (Qiagen、ヒルデン、ドイツ) を使用して全 RNA を抽出しました。 10 個の器官および構造をプールして個別のサンプルを生成し、すべての定量的逆転写 PCR (qRT-PCR) 実験にはサンプルサイズ 3 を使用しました。 RNA および潜在的なゲノム DNA 濃度は Qbit 2.0 (Invitrogen、Thermo Fisher Scientific) を使用して測定し、RNA の品質は NanoDrop 1000 分光光度計 (Thermo Fisher Scientific) を使用して確認しました。各サンプルからの RNA の 250 ng アリコートを、iScript™ Reverse Transcription Supermix for RT-qPCR (Bio-Rad Laboratories) を使用して逆転写し、cDNA を生成しました。ゲノム DNA 汚染がないことを確認するために、iScript™ noRT Supermix (Bio-Rad Laboratories) を使用して非逆転写 (noRT) サンプルを生成しました。 gcn1 のプライマーは、PrimerBLAST [42] を使用して設計され、NetPrimer (Premier Biosoft、米国カリフォルニア州パロアルト) で評価されました。プライマーは、mRNA とゲノム DNA 増幅産物を区別するためにイントロン配列に隣接するように設計されました。ビテロゲニン (vg)、ベータアクチン (β-アクチン)、およびリボソームプロテイン S7 (rps7) 遺伝子のプライマーは以前に公開されています [45、46] (すべてのプライマー配列については表 3 を参照)。すべての qRT-PCR プライマーは、標準的な脱塩精製 (Eurofins Genomics、ルイビル、ケンタッキー州、米国) を使用して 10 nmol スケールで合成されました。

参照遺伝子の発現は、卵黄形成中の異なる臓器間または異なる時点で異なる可能性があるため、RefFinder [47] ツールを使用して、各 qRT-PCR アッセイで最も安定して発現される参照遺伝子を特定しました。成人の器官および構造における gcn1 発現プロファイリングでは、rps7 が適切な参照であると判断され、一方、RNAi 処理後の vg 転写のアッセイでは β-アクチンが適切な参照であると判断されました。すべての qRT-PCR 実行は、cDNA をヌクレアーゼフリー水で 1:1 に希釈し、以下の成分を透明な 96 ウェルプレート (Genesee Scientific、エルカホン、カリフォルニア州、米国) 内で氷上で混合することによって実行されました。 5 μl iTaq Universal SYBRgreen Supermix ( Bio-Rad Laboratories)、1 μl の 1:1 混合フォワードおよびリバース遺伝子特異的プライマー、1 μl の希釈 cDNA、および 2 μl のヌクレアーゼフリー水。プレートを短時間スピンダウンしてウェルの底にあるすべての材料を収集し、ThermalSeal RTS™ 透明プラスチック接着フィルム (Excel Scientific Inc.、Victorville、CA、USA) でシールしました。すべての qRT-PCR アッセイは、CFX Maestro ソフトウェア (Bio-Rad Laboratories) と次のサイクルプロファイルを使用してコンピューターによって制御される CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad Laboratories) で実行されました: 95 °C での初期変性30秒間。続いて、95 °C で 5 秒間の変性と 60 °C で 30 秒のアニーリング/伸長の組み合わせを 40 サイクル行います。各伸長ステップの後に蛍光測定を実施した。 65 °C から 95 °C まで 0.5 °C 刻みで各ステップで 5 秒保持した融解曲線を、各 qRT-PCR の直後に実行しました。プライマーペアの増幅効率は、Real-Time PCR Miner ツールの生の蛍光データを使用して決定されました [48]。各サンプルの技術的複製からの平均定量サイクル (Cq) 値は、Real-Time PCR Miner ツールによって決定されたプライマーペア効率を使用して分析され、gcn1 または vg Cq 値はそれぞれ rps7 または β-actin Cq 値に正規化されました。遺伝子発現の変化を定量化します。

女性のAeのグループ。上記の本文に記載されているように、ネッタイシマカ（羽化後 5 ～ 7 日）に GCN1 dsRNA または GFP dsRNA を注射しました。注射（PI）から 5 日後、37 °C に温めた脱繊維ウシ血液（HemoStat Laboratories、ディクソン、カリフォルニア州、米国）を使用して、両グループの生存蚊に 1 時間給血しました。個々の充血した蚊を産卵室に移動し、卵黄形成と産卵を完了するのに十分な時間を確保するために、上記の飼育条件で 96 時間維持しました。各卵室からの卵紙を収集し、各処理からの平均クラッチサイズを決定するために計数する前に、96 時間乾燥させました。計数後、卵をさらに最低 72 時間乾燥させました (合計少なくとも 1 週間の乾燥)。孵化率を決定するために、各処理からの 12 個のエッグペーパーをランダムに選択し、脱イオン水とスペシャルキティキャットフード (Walmart Stores Inc.) の 4 分の 1 ペレットを入れた小さな皿に置き、孵化させました。卵の各クラッチからの幼虫数を、各クラッチで数えられた卵の数と比較して、孵化率を計算しました。

羽化後 5 ～ 7 日のメスの蚊に、上記のように GFP または GCN1 dsRNA を注射しました。感染後 5 日目に、メスの蚊に血液ミールを与え、1 時間摂食させました。給血の直前に、給餌されていないベースラインサンプルとして使用するために、注射された雌のグループが分離されました。 10 匹の吸血蚊のグループを、吸血後 24、48、および 72 時間 (PBM) にサンプリングしました。 2 つの注射処理 (GFP または GCN1 dsRNA) および 4 つの時点 (無給餌、24 時間 PBM、48 時間 PBM、72 時間 PBM) のそれぞれからの蚊を氷上で麻酔し、それらの卵巣を解剖しました。各蚊 (n = 10) の両方の卵巣を測定し、平均して、各治療および時点での蚊あたりの平均卵巣長を決定しました。蚊 1 匹あたり 5 個の卵母細胞 (n = 10) を測定し、各治療タイプおよび時点で各蚊からの平均卵母長を決定しました。

追加の統計検定を選択する前に、シャピロ・ウィルク検定と QQ プロットを使用して、すべてのデータの分布の正規性検定を実行しました。成人女性の器官および構造からの GCN1 qRT-PCR データを一元配置分散分析 (ANOVA) を使用して分析し、サンプル間の有意差を Tukey の HSD 事後検定を使用して決定しました。異なる時点での GCN1 と GFP dsRNA を注入したサンプル間のリン酸化 eIF2α レベルの違いウェスタンブロットバンド濃度測定法で測定した PBM を、一元配置 ANOVA とそれに続く Tukey の HSD 事後検定を使用して分析し、各時点での治療間の有意差を特定しました。 qRT-PCRによって測定されたGCN1およびGFP dsRNA注入サンプル間のvg発現の差異を、各時点で対応のないt検定を使用して分析しました。 GCN1 および GFP dsRNA を注射した蚊の卵巣および卵母細胞の長さの違いも、各時点で対応のない t 検定を使用して分析しました。卵数と孵化率の違いは、マンホイットニー U 検定を使用して分析されました。 dsRNA を注射された蚊の生存曲線は、ログランクマンテル-コックステストを使用して分析されました。 P 値 < 0.05 は、すべてのテストで統計的に有意であるとみなされました。すべての統計分析は、Prism 8 統計分析ソフトウェア (GraphPad Software、米国カリフォルニア州サンディエゴ) を使用して実行されました。

以前の出版物では、Ae の完全な SLC7 遺伝子ファミリーに注釈を付けました。ネッタイシマカ [32]、5 つの注釈付き CAT のうち 2 つの基質親和性と輸送活性を特定しました [35、36]。これらの研究に続いて、Ae の新しいゲノム注釈が公開されました。ネッタイシマカ [49, 50]。これらの自動アノテーションの一部は特定の CAT に一貫性のない番号を割り当てていたため、Entrez Gene で利用可能な現在のアノテーションと、FlyBase バージョン FB2021_04 の現在の D. melanogaster CAT グループを使用して、以前の CAT レコード [32] に再アノテーションを付けることを選択しました。 37] 進化の背景については (追加ファイル 1: 表 S1 を参照)。 MEGA11の複数のタンパク質アラインメント[38]により、AaCAT1とAaCAT3の両方がキイロショウジョウバエのスリムファスト（Slif）に最も近くにクラスター化しており（図1a）、したがってハエと蚊の間の進化的分裂後の共通祖先からの遺伝子重複を表す可能性が高いことが明らかになりました。、2億5000万年前（MYA）[51]。さらに、この分析中に、Ae の 2 つの異なる遺伝子エントリを特定しました。ネッタイシマカ CAT2 と Ae の 2 つの異なる遺伝子エントリ。 Entrez Gene データベース内のネッタイシマカ CAT3。私たちの隣接結合木には 1 つの Ae が集まっていました。ネッタイシマカ CAT2 (GeneID: 5575859) と AaCAT1 アノテーション [32]、他の Ae. ネッタイシマカ CAT2 (GeneID: 5571884) は、AaCAT2 アノテーション [32] でクラスター化されました (図 1a)。さらに、2 つの Ae のうちの 1 つ。ネッタイシマカ CAT3 アノテーション (GeneID: 5575863) は、AaCAT3 アノテーション [32] とクラスター化されていますが、他の Ae. ネッタイシマカ CAT3 アノテーション (GeneID: 5575110) は、Ae とクラスター化されました。エジプトカチオン性アミノ酸トランスポーター 5 (AaCAT5) アノテーション [32] (図 1a)。

AaCAT1 系統発生および相互作用スクリーニング。 AaCAT1 および AaCAT3 は、ショウジョウバエ Slif CAT ファミリーの拡張を表します。ネッタイシマカのCATタンパク質配列はNCBIタンパク質データベースからダウンロードし、キイロショウジョウバエ(Dmel)のCATタンパク質配列はFlyBaseバージョンFB2021_04からアクセスした[37]。タンパク質配列は MEGA11 [38] を使用してアラインメントされ、複数の配列アラインメントから MEGA11 で隣接結合ツリーが生成されました。各ノードの横の数字は、500 個のレプリケーションに基づくブートストラップ値を表します。 AaCAT1 と AaCAT3 は両方とも、Ae では以前に Slif として注釈が付けられていました。ネッタイシマカ。私たちの現在のアセンブリは、両方のトランスポーターがキイロショウジョウバエの Slif と相同性を共有し、Ae 期の Slif トランスポーターファミリーの拡大を表すことを示しています。ネッタイシマカの進化。 AaCAT1 の周りの赤いボックスは、タンパク質相互作用アッセイでの使用を示しています。 Dmel が先頭にない遺伝子名はすべて Ae です。ネッタイシマカ CAT アノテーション。遺伝子クラスターを囲む括弧は、Ae の提案された再アノテーションを表します。このツリーに基づくネッタイシマカ CAT。 b AaCAT1 の予測される膜貫通構造。 Protter ウェブベースのアプリケーション [40] を使用して、14 の膜貫通ヘリックスを説明しました。基質特異性部位はマークされており [34]、Y2H アッセイでベイトに使用される C 末端の 28 アミノ酸フラグメントは、その一文字アミノ酸コードを含む丸で示されています。 c Y2H アッセイによって決定された少なくとも 2 つの異なるヒットを持つ上位 5 つの相互作用タンパク質を含む表。 d プルダウン用の AaCAT1 ベイトフラグメントおよび GCN1 相互作用フラグメント。 e AaCAT1-GCN1相互作用のプルダウン分析。 AaCAT1 C 末端ドメインを脂肪体タンパク質とインキュベートし、得られた複合体をコバルト樹脂上に捕捉しました。 6-His タグ付き AaCAT1 ベイトフラグメント (d と同じ) を使用した架橋 (x 結合) および非架橋 (non) プルダウン反応のクーマシーブルー染色と脂肪体タンパク質により、予想されたサイズで溶出されたバンドが明らかになります。 GCN1 相互作用の場合 (矢印でマーク)。 f GCN1 は AaCAT1 の C 末端に結合します。プルダウンアッセイ画分のウェスタンブロットにより、プルダウン溶出画分 (矢印でマーク) に GCN1 が存在することが確認されます。ベイト、ベイトのみのコントロール。 FT、フロースルー画分。溶出、溶出画分; PD、プルダウン。樹脂、樹脂コントロール; 洗浄、樹脂洗浄画分。 Y2H、酵母ツーハイブリッド。他の用語については、略語を参照してください。

PyMOL 分子ビューアツール (https://pymol.org/2/) と TMHMM v2.0 膜貫通予測ツール [39] を使用した AaCAT1 アミノ酸配列のインシリコ分析により、タンパク質の三次構造を予測することができました (追加ファイル 1: 図 S1a)、タンパク質の膜貫通領域、細胞内領域、および細胞外領域を特定します (追加ファイル 1: 図 S1b)。我々は、これらの予測ドメインを Verrey ら [34] によって定義された CAT 構造と組み合わせて使用し、酵母ツーハイブリッドスクリーニングに使用する AaCAT1 の C 末端を選択しました。また、タンパク質局在予測ツール DeepLoc-1.0 [52] (追加ファイル 1: 図 S1c) を使用して、AaCAT1 が細胞膜とリソソームに局在する可能性が高いことも決定しました。

AaCAT1のC末端テールをベイトとして使用した酵母ツーハイブリッドスクリーニング（図1b）により、QDO高ストリンジェンシー選択培地上でレポーター遺伝子活性化の完全な相補体を有する207個のコロニーが得られました（追加ファイル2：データセット）。これらのコロニーからプレイプラスミドを単離し、配列を決定しました。プレイプラスミド配列分析とプレイタンパク質の既知の組織および細胞内局在に基づいて明らかな偽陽性と可能性の高い偽陽性の両方を除去した後、13 個の可能性のあるタンパク質相互作用因子が残りました（追加ファイル 1: 表 S2）。これらのうち、5 つの相互作用因子が少なくとも 2 つの異なるコロニーで検出されました (図 1c)。 eIF2-αキナーゼ活性化因子であるGCN1は、これらの中で最も興味深いものでした。GCN1のC末端から相互作用するペプチドをコードするプラスミドを含む2つの別々のクローンに由来する3つの異なるコロニーを同定したからです（図1c、d）。他の真核生物における GAAC の翻訳制御に関与していることが以前に証明されています [7、9、10、14、53]。

我々は、酵母ツーハイブリッドベイトに使用したAaCAT1 C末端の同じ28アミノ酸長の配列に対応する6-Hisタグ付きペプチドを設計することにより、AaCAT1とGCN1の間の相互作用を確認した。クマシーブルー染色により、架橋プルダウンアッセイと非架橋プルダウンアッセイの両方の溶出画分に> 260 kDaのバンドが保持されていることが明らかになりました（図1e）。抗GCN1抗体を用いた非架橋プルダウンアッセイサンプルのウェスタンブロッティングにより、プルダウン溶出画分にGCN1が存在することが確認されました（図1f）。

qRT-PCR によって検出された成人女性の臓器における GCN1 転写物は、血粉消化および卵黄形成に関連する臓器で最も高かった。相対的な GCN1 mRNA レベルは、頭部、胸部、およびマルピーギ尿細管よりも卵巣で有意に高かった (卵巣/頭部: ANOVA、F(5,12) = 6.391、P = 0.0033; 卵巣/胸部: ANOVA、F(5,12) = 6.391、P = 0.0094;卵巣/マルピーギ尿細管: ANOVA、F(5,12) = 6.391、P = 0.0212) (図 2a)。卵黄形成に必要な他の器官である脂肪体および中腸は、卵巣と有意差のないレベルで GCN1 mRNA を発現しました (卵巣/脂肪体: ANOVA、F(5,12) = 6.391、P = 0.2028; 卵巣/中腸: ANOVA、F(5,12) = 6.391、P = 0.1877)。成人女性器官のウェスタンブロット分析により、GCN1 タンパク質レベルが卵巣で最も高いことが明らかになりました。また、脂肪体とマルピーギ尿細管では GCN1 タンパク質が検出されましたが、興味深いことに中腸では検出されませんでした。最後に、頭部と胸部の両方で低レベルの GCN1 タンパク質が検出されました。この発現パターンは、AaCAT1が以前に検出された多くの臓器のパターンと一致し[36]、卵黄形成に関与する主要な組織には検出可能なレベルのAaCAT1とGCN1の両方が含まれています。 DeepLoc-1.0 [52] を使用した GCN1 細胞内局在のインシリコ解析では、GCN1 はサイトゾルに局在する可能性が最も高いが、核にも局在する可能性があり (追加ファイル 1: 図 S2a)、cNLS を使用して予測されたように、複数の推定核局在配列が含まれていることを示しています。マッパーツール [54] (追加ファイル 1: 図 S2b、c)。

GCN1 は生殖関連組織で発現し、そのシグナル伝達活性は RNAi 媒介ノックダウン後に低下します。成人組織における GCN1 発現の qRT-PCR プロファイリング (上) および GCN1 タンパク質発現のウェスタンブロッティング (下) により、卵巣、脂肪体、およびマルピーギ尿細管における GCN1 の発現が明らかになりました。一元配置分散分析 (ANOVA) とそれに続く Tukey の HSD 事後検定を使用して、gcn1 転写産物発現の有意差 (P < 0.05) を決定しました。ウェスタンブロット検出のために、各サンプルからのタンパク質の 15 μg アリコートをロードしました。 b dsRNA注入後のGCN1発現のウェスタンブロット。 c GFP dsRNA治療と比較したGCN1発現の割合は、注射後3日目および5日目（PI）で同様のGCN1発現の減少を示し、PI7日目までに相対的なGCN1発現の増加が始まりました。 2b の GCN1 バンド (293 kDa、矢印) のピクセル強度は、すべてのサンプルにわたって同様の強度を有する明るい約 50 kDa バンド (矢印) のピクセル強度を使用して標準化されました。各サンプル (n = 1) について 10 匹の蚊全体のプールから総タンパク質を抽出し、各サンプルから 15 μg のタンパク質を分析しました。 d GCN1 dsRNAまたは緑色蛍光タンパク質（GFP）dsRNAのいずれかを注射した後、中腸を除去した5人の女性腹部（n = 3）の3つのプールからのホスホeIF2α（p-eIF2α）、eIF2α、およびアクチンの代表的なウェスタンブロット。注射された蚊は、血液食事後 (PBM) のさまざまな時点でサンプリングされました: 0 (給餌なし)、6、12、または 24 時間 PBM。各サンプルからの総タンパク質の 10 μg アリコートをロードしました。 e 2dのブロットにおけるGCN1を注入した蚊およびGFPを注入した蚊からのp-eIF2αバンドのピクセル強度を2dのeIF2αバンドのピクセル強度に正規化し、異なる時点PBMでのp-eIF2αバンド強度の変化をプロットしました。文字は、治療群と時点間の有意差について、一元配置分散分析とその後の Tukey の HSD 事後検定による分析によって決定された統計的有意群 (P < 0.05) を表します。 FB、脂肪体。彼、頭。 OV、卵巣。 MG、中腸。 TH、胸部。 MT、マルピーギ尿細管。 WM、蚊全体。他の用語については、略語を参照してください。

RNAi 操作の最適な時間枠を決定するために、少数のメスの蚊に GCN1 dsRNA または GFP dsRNA のいずれかを 1 μg 注射し、3、5、7 日目に 10 匹の蚊 (n = 1) のプールから総タンパク質を単離しました。日々PI。哺乳動物GCN1に対する抗体を用いてウェスタンブロットを実行し、すべてのサンプルにおけるGCN1タンパク質の発現を調べました（図2b）。この一次抗体を用いたウェスタンブロットでは、すべてのサンプルで一貫した強度を持つ約 290 kDa の GCN1 バンドと約 50 kDa の追加のバンドが示されました (追加ファイル 1: 図 S4d を参照)。バンド濃度測定を使用して GCN1 バンド (293 kDa) のピクセル強度を半定量化し、それらを準内部ローディングコントロールとして使用した 50 kDa バンドに正規化しました。各時点での GFP RNAi サンプルと比較した GCN1 RNAi サンプルの GCN1 バンド強度の減少率をグラフにしました。3 日および 5 日の PI サンプルの両方で GCN1 タンパク質レベルの約 60% の減少が観察されました（図 2c）。

AeにおけるGCN1の役割を解明する。ネッタイシマカ卵黄形成において、GCN1 遺伝子発現をノックダウンする抗 GCN1 dsRNA を設計および合成しました。 GCN1 は他の生物において栄養シグナル伝達と飢餓反応に関与していることが示されている [9、10、11、12、14、15、53] ため、GCN1 のノックダウンが急速な致死性を引き起こし、将来のノックダウンに有害であるかどうかを理解したいと考えました。 Aeでの実験。ネッタイシマカ。 GCN1 ノックダウンの致死性を評価するために、約 200 匹のメスの蚊に 1 µg GCN1 dsRNA (n = 199) または 1 µg GFP dsRNA (n = 205) を注射対照として注射し、PI 5 日間にわたる死亡率を測定しました。両方のグループ、つまりノックダウングループとGFPコントロールグループは、PI5日目の生存率が80％を超えていました（追加ファイル1：図S3a）。 GCN1 dsRNA を注入した蚊の生存率は、測定したどの時点でも、GFP dsRNA を注入した対照の生存率と有意な差はありませんでした (ログランクマンテル-コックス検定、χ2 = 0.02547、df = 1、P = 0.8732) (追加ファイル 1) ：図S3a）。

GCN1 が GCN2 を調節し、それにより eIF2α がリン酸化され、酵母におけるタンパク質の翻訳が調節されることが知られています [12、14]。 GCN1 dsRNA注射が機能的なGCN1活性ノックダウンを引き起こしたかどうかをテストするために、血液を避けるために中腸を除去した状態で、異なる時点PBM（すべての時点でn = 3）で5匹の蚊の腹部から単離された総タンパク質の3つのプールに対してウェスタンブロットを実行しました。汚染（図2d;追加ファイル1：図S4e–g）。各グループの無給餌蚊と比較して、6 時間 PBM で両方の治療グループで eIF2α リン酸化の有意な減少が観察されました (GCN1 無給餌-GCN1 6 時間 PBM: ANOVA、F(7,16) = 5.562、P = 0.0128; GFP 無給餌- GFP 6 時間 PBM: ANOVA、F(7,16) = 5.562、P = 0.0183) (図 2e)。これは、GAAC 経路が女性の Ae における活性な栄養素感知スイッチであることを示しています。ネッタイシマカは卵黄形成中に血液粉を代謝します。

治療群間のeIF2αリン酸化を比較すると、すべての時点でGFP dsRNAを注射した蚊と比較して、GCN1 dsRNAを注射した蚊ではリン酸化eIF2αのレベルの低下が観察されました（図2d、上のパネル）（図2e）。ただし、この減少は測定されたどの時点でも有意ではありませんでした (無給餌: ANOVA、F(7,16) = 5.562、P = 0.9732; 6 時間 PBM: ANOVA、F(7,16) = 5.562、P = 0.9340; 12 h PBM: ANOVA、F(7,16) = 5.562、P = 0.9890; 24 時間 PBM ANOVA、F(7,16) = 5.562、P = 0.9506)。ローディングコントロールとして使用した総eIF2αとアクチンのレベルは両方の処理で同様でした（図2d、中央および下のパネル）。これにより、GCN1 dsRNAを注入した蚊で観察されたeIF2αリン酸化の減少はノックダウンによるものであるという確信が得られました。処理。

PI 5日目にGCN1 dsRNAとGFP dsRNAの両方を注射した蚊に血液を与え、vg発現のqRT-PCR分析のためにPBMの異なる時点で蚊のグループをサンプリングしました。 GFPを注射した蚊では、無給餌状態と比較してvg mRNA 24h PBMが2000倍増加することが観察されました（追加ファイル1：図S3b）。興味深いことに、GCN1 dsRNAを注射した蚊ではvg mRNAがほぼ3800倍増加したため、GFPを注射した蚊と比較してGCN1を注射した蚊ではvg発現の減少は観察されませんでした（追加ファイル1：図S3b）。 vg mRNA の発現は、測定したどの時点でも有意な差はありませんでした (無給餌: 対応のない t 検定、t(4) = 1.299、P = 0.2637; 6 時間の PBM: 対応のない t 検定、t(4) = 0.2851、P = 0.7897; 12 時間 PBM: 対応のない t 検定、t(4) = 1.275、P = 0.2713; 24 時間の PBM: 対応のない t 検定、t(4) = 0.1612、P = 0.8797)。

蚊の繁殖力に対するGCN1ノックダウンの影響を調べるために、GCN1またはGFP dsRNAを雌の蚊に注射し、無給餌（0時間PBM）群と24時間、48時間、および72時間PBMで給血した雌のグループから卵巣を解剖しました（図1）。 3a)。 GCN1 を注射した蚊では、最初の 48 時間 PBM を通じて卵巣の長さがより速く成長し、24 時間 PBM では長さが大きく異なりました (24 時間 PBM: 対応のない t 検定、t(18) = 2.333、P = 0.0314 ; 48 時間 PBM: 対応のない t 検定、t(18) = 0.8753、P = 0.3930)。しかし、GCN1を注射した蚊の卵巣は、その長さにおいてGFPを注射したメスの卵巣に追い越され、PBM48時間から72時間にかけて成長を停止したが、その差は有意ではなかった(対応のないt検定、t(18) = 1.982、P) = 0.0629) (図 3b)。卵母細胞の長さは、測定したどの時点でも差はありませんでした（非給餌: 対応のない t 検定、t(18) = 1.571、P = 0.1335; 24 時間 PBM: 対応のない t 検定、t(18) = 1.339、P = 0.1972; 48 h PBM: 対応のない t 検定、t(18) = 0.09389、P = 0.9262; 72 h PBM: 対応のない t 検定、t(18) = 0.4433、P = 0.6628) (図 3c)。

GCN1 ノックダウンは蚊の繁殖力に影響を与えます。 a 記載の時間 PBM に GCN1 dsRNA または GFP dsRNA を注射した蚊から画像化された代表的な卵巣。各画像のスケールバー: 500 μm。 b、c 卵巣の長さ（b）および5つの代表的な卵母細胞の長さ（c）は、0時間のPBM（給餌なし）でサンプリングされた10匹のGCN1 dsRNA注入（n = 10）または10個のGFP dsRNA注入（n = 10）の蚊から測定されました。、24 時間 PBM、48 時間 PBM、または 72 時間 PBM。データは、10 個の卵巣対 (b) または卵母細胞 (c) の平均長さ ± 平均値の標準誤差として表示されます。対応のある t 検定を使用して、各時点での GCN1 dsRNA を注入した卵巣と GFP dsRNA を注入した卵巣および卵母細胞の長さの差の統計的有意性を判定しました。 d GFP dsRNAを注入した蚊（n = 18）およびGCN1 dsRNAを注入した蚊（n = 23）の卵の数。 dsRNA を注射した個々の雌に PI の 5 日間給血し、個々の産卵室に分けました。産卵した卵を含む卵紙を96時間PBMで収集し、計数する前に48時間乾燥させた。各点は、1 匹の蚊が産む卵の数を表します。線とひげは卵数の中央値 ± 四分位範囲 (IQR) を表します。 e パート c で注入された蚊からランダムに選択された 12 個 (n = 12) のクラッチの孵化率。線とひげは、クラッチごとに孵化した卵の中央値パーセント±IQRを表します。卵子数と孵化率データの統計的有意性 (P < 0.05) は、GraphPad Prism 8 ソフトウェアを使用した Mann-Whitney U 検定で決定されました。

GCN1 dsRNA (n = 23) と GFP dsRNA (n = 18) の両方の蚊を注射した蚊のクラッチサイズを測定しました。 GCN1 ノックダウンは、GFP を注入した対照と比較してクラッチサイズの有意な（マン・ホイットニー U 検定、U(39) = 92.50、Z = − 3.01、P = 0.0021）減少を引き起こし、一クラッチあたりの卵の中央値は 63 個でした。 GCN1治療群は、GFP対照群の1クラッチあたり88.5個の卵の中央値と比較しました（図3d）。また、GCN1 ノックダウンおよび GFP dsRNA を注入した対照蚊のランダムに選択した 12 個体からの孵化率も測定しました。 GCN1 ノックダウン蚊が産んだクラッチの孵化率中央値は 53%、対照クラッチの孵化率中央値は 75% でした。この差は統計的に有意な差ではありませんでした（マン・ホイットニーU検定、U（22）= 44、Z = - 1.62、P = 0.1135）（図3e）。

この研究では、蚊の脂肪体、卵巣、その他の組織の栄養センサーの一部である可能性が高いシグナル伝達タンパク質の新しいセットを特定しました[6、30、31、35、36、45、55、56]。私たちは、CAT の C 末端の推定上の相互作用パートナーとして GCN1 を発見し、GCN1 のノックダウンがアミノ酸誘導性の栄養シグナル伝達と蚊の繁殖力に影響を与えることを示しました。

我々は、SLC7 型アミノ酸トランスポーター遺伝子ファミリーの 5 つの蚊 CAT タンパク質に再アノテーションを付けることから研究を開始しました [32、34、57]。 NCBI 遺伝子データベースには、Ae に関する 2 つの異なるエントリが含まれています。 aegypti CAT2 および CAT3 (AaCAT2、AaCAT3)、Ae のエントリはありません。ネッタイシマカ CAT1 または CAT5 (AaCAT1、AaCAT5)。私たちの分析（図1a）は、CAT2（GeneID：5575859）遺伝子エントリのCAT1としての再アノテーション、およびCAT3（GeneID：5575110）遺伝子エントリのCAT5としての再アノテーションをサポートしています。 AaCAT1とAaCAT3は両方ともキイロショウジョウバエのSlifと一緒にクラスター化しており（図1a）、AaCAT1とAaCAT3がAeの進化の歴史におけるSlif CATファミリーの拡大を表すことを示しています。ネッタイシマカ。以前の研究で、これらの密接に関連したタンパク質はどちらもアミノ酸トランスポーターであるが、基質特異性が完全に異なることを示しました。 AaCAT3は幅広い基質特異性を持ち、4種類のカチオン性アミノ酸すべてだけでなく、いくつかの非荷電アミノ酸も輸送する[35]一方、AaCAT1は脂肪体の栄養センサーの一部である独特のヒスチジン特異的トランスポーターである[36]。 AaCAT1 ノックダウンは脂肪体の栄養素シグナル伝達を妨害し、ラパマイシン (TOR) シグナル伝達経路の標的内の上流に位置することが示されているため [30]、我々は相互作用する細胞質タンパク質を同定するためのベイトとして AaCAT1 C 末端を選択しました。

AaCAT1 C末端の酵母ツーハイブリッドスクリーニングでは、AaCAT1の相互作用因子と考えられる33個のタンパク質ヒットが生成されました。これらの多くは AaCAT1 の真の相互作用物質である可能性があり、さらなる研究の候補となるでしょう。全体として、我々が同定した強力に相互作用するタンパク質のコレクション（図1c）は、AaCAT1が、荷電アミノ酸の輸送に関連する電荷分布を管理し、さまざまな代謝反応を調節するように設計された複合体の一部である可能性を示唆しています。

GCN1 は、真核生物におけるアミノ酸飢餓時のタンパク質合成の制御に関与しているため、我々が同定した最も興味深い候補でした [9、10、11、12、14、15、53、58]。我々は、His タグ付き AaCAT1 ベイトとタンパク質溶解物プレイによる in vitro プルダウンを使用して、AaCAT1 と GCN1 の間のこの相互作用を検証しました。これは、別のタンパク質がこの相互作用を橋渡しする可能性を排除するものではありません。これが直接的な相互作用であることを完全に確認するには、精製された AaCAT1 ベイトと GCN1 プレイを使用した in vitro プルダウンを実行する必要があります。しかし、複数のアッセイを通じてこの相互作用を検出したことにより、相互作用が直接的であるか架橋的であるかに関係なく、この相互作用が生体内で起こる可能性が高いという確信が得られます。酵母では、GCN1はキナーゼGCN2を含むいくつかのタンパク質と複合体を形成し、この複合体はリボソームに結合し、そこでGCN2はアミノ酸飢餓状態中に非荷電tRNAを感知して活性化することができる[12、13、14、15]。 GCN2 が活性化されると、真核生物の翻訳開始因子 2 複合体 (eIF2α) のアルファサブユニットがリン酸化され [12、13、14、15、16]、その結果、一般的な翻訳が下方制御され、少数の翻訳の刺激が引き起こされます。アミノ酸代謝を調節する転写因子 ATF4 (酵母における一般制御非抑制性 4 [GCN4]) を含む遺伝子 [20、21、59]。さらに、このシグナル伝達経路は、真核生物における mTOR 活性の制御に関与していると考えられています [23、26]。これまでの研究では、mTOR シグナル伝達が蚊の卵黄形成の中心であることが実証されており [6、31、45、55]、アミノ酸の利用可能性が Ae における mTOR および S6K 活性に影響を与えることが示されています。ネッタイシマカ [30,31,32,45]。

AaCAT1 相互作用領域は GCN1 の C 末端にあり、酵母のリボソームまたは GCN2 相互作用部位と重複しないため [14、60]、AaCAT1 と相互作用する GCN1 はリボソームのドッキング部位として機能する可能性があると我々は提案します。このように相互作用すると、GCN1は細胞のアミノ酸状態の変化を迅速に感知し、リボソームをアミノ酸濃度の高い領域に動員することによってYPP翻訳の効率を高めることができると考えられる。また、GCN1 との相互作用が AaCAT1 の活性化や卵黄形成中のトランスポーターの安定性の維持に必要である可能性もありますが、GCN1 ノックダウンデータはこの考えを裏付けるものではありません。ただし、GCN1 ノックダウン後の AaCAT 活性をさらにアッセイしない限り、この可能性は排除できません。私たちが観察した AaCAT1 と GCN1 の間の相互作用は、細胞内のいくつかの場所で起こる可能性があります。まず、GCN1 と AaCAT1 は細胞の原形質膜で相互作用する可能性があります。第二に、AaCAT1 が細胞膜に輸送される際に、GCN1 と AaCAT1 が分泌小胞で相互作用する可能性があります。最後に、GCN1 と AaCAT1 はリソソームで相互作用する可能性があります。 AaCAT1 は細胞膜またはリソソームのいずれかに局在すると予測されており (追加ファイル 1: 図 S1)、リソソームはアミノ酸の貯蔵部位 [61] およびアミノ基のハブとして機能することが知られているため、この相互作用の位置は可能です。 TOR 経路による酸シグナル伝達 [62、63]。卵黄形成中にGCN1、mTOR、リソソームの間にどのような関係が存在するのか、またこれらの相互作用が細胞内のどこで起こるのかを解明するには、さらなる研究が必要である。 GCN1がどのようにmTORシグナル伝達と交差するかを理解するために、GCN1タンパク質断片をベイトとして使用する酵母ツーハイブリッド研究により、GCN1とmTORシグナル伝達経路におけるタンパク質との間の相互作用が特定される可能性がある。さらに、クラスター化された規則的に間隔が空いた短い回文リピート/CRISPR 関連タンパク質 9 (CRISPR/Cas9) 遺伝子編集や、受容体媒介卵巣カーゴ形質導入 (REMOT コントロール) などの技術の出現により、CRISPR/Cas9 を使用して遺伝的タンパク質を開発できるようになりました。成虫のメスの蚊を注射することによって系統を作製することにより[64]、GCN1 または mTOR シグナル経路タンパク質ノックアウト系統の生成が可能になります。これにより、GCN1 または mTOR シグナル伝達がヌルの遺伝的背景での実験のデザインが可能になり、GCN1 および GAAC 経路がどのように mTOR シグナル伝達とクロストークして卵黄形成を調節するのかをさらに解明できます。 CRISPR/Cas9 ベースの編集では、相同性指向修復を利用して、蛍光標識を GCN1 または mTOR シグナル伝達遺伝子に正確にノックインすることもでき、蛍光共鳴エネルギー転移 (FRET) などの蛍光技術を使用して GCN1 かどうかを識別することができます。 Ae 内の mTOR または他の mTOR シグナル伝達タンパク質と直接相互作用します。卵黄形成前および形成中のさまざまな時点でのネッタイシマカの脂肪体または他の組織。

ローディングコントロールとしてeIF2αに対して正規化したリン酸化eIF2αのウエスタンブロットバンド濃度測定は、GCN1 dsRNAまたはGFP dsRNAのいずれかを注射した蚊におけるeIF2αリン酸化6時間PBMの有意な減少を示した（図2d、e）。この変化は、雌の蚊がスクロース（実験室）または花蜜（野生）の低アミノ酸食から高アミノ酸含量の血液粉に移行する際に、GAAC経路が栄養感覚に関与している場合に予想される。我々は、この結果を、GAAC経路が卵黄形成の開始時にYPPを生成する代謝スイッチの媒介において積極的な役割を果たしていることを示していると解釈する。 GAAC経路活性に対するGCN1ノックダウンの影響をアッセイするとき、血粉前および最初の24時間のPBMにおいて、GFP dsRNAを注射した蚊と比較して、GCN1 dsRNAを注射した蚊におけるeIF2αリン酸化の減少が観察されました（図2d、e）。。この減少の統計分析では、eIF2αリン酸化に対する有意なノックダウン効果は明らかにされませんでした。 GCN2 キナーゼ活性は、他の真核生物においてリボソーム P 茎によって調節されていることが示されている [65, 66]。そのため、蚊のリボソーム P 茎による GCN2 活性化における機能的重複が、なぜ我々が有意でない減少を観察したのかを説明する可能性がある。 GCN1発現をノックダウンした後のeIF2αリン酸化。

興味深いことに、GCN1 ノックダウンは qRT-PCR で検出された vg mRNA の発現に影響を与えませんでしたが (追加ファイル 1: 図 S3b)、GFP dsRNA 対照と比較して、GCN1 dsRNA を注射された雌蚊の繁殖力の違いが観察されました (図 S3b)。 3）。我々は以前、本研究で使用したものと同等のサンプルサイズを使用した繁殖力と孵化率のデータを発表した[67]ので、我々のデータは繁殖力に対するGCN1ノックダウンの影響を正確に表していると確信しているが、今後の実験は正確な結果を理解するために設計される。蚊の繁殖力において GCN1 が果たす役割には、より大きなサンプルサイズが含まれるでしょう。 GCN1 のノックダウンは、20-ヒドロキシエクジソン (20-E) シグナル伝達、幼若ホルモンシグナル伝達、インスリン様ペプチドシグナル伝達など、YPP 遺伝子転写に必要であることが知られている他の因子を阻害すべきではありません [31]。我々は、我々が行った実験において、GCN1 ノックダウンが YPP 遺伝子転写に影響を与えることなくクラッチサイズにどのように影響するのかについて、考えられる 3 つの説明を提案します。第一に、これらの結果は、リボソーム P 茎タンパク質による GCN2 活性化の機能的重複によるものである可能性があります。第二に、これらの結果は、GCN1 dsRNA 処理蚊の血中ミールにおけるタンパク質翻訳の増加によって引き起こされ、血中ミール前のアミノ酸貯蔵量が枯渇し、YPP 合成効率の低下が引き起こされた可能性があります。第三に、GCN1 ノックダウンは卵黄形成中にリボソーム動員の障害を引き起こし、YPP 合成の効率を低下させる可能性があります。 GCN1 ノックダウン蚊における今後のメタボロミクスおよびプロテオミクス研究、およびリボソーム精製研究により、これらのメカニズムのいずれかが GCN1 を介した繁殖力の変化にどのような役割を果たしているのかについての洞察が得られるでしょう。

GCN1の局在を解析したところ、GCN1は血粉栄養素の処理と卵黄形成に関与する組織、特に卵巣、脂肪体、中腸で高レベルで発現していることが示された。興味深いことに、餌を与えられていない雌の蚊の中腸では、qRT-PCR で GCN1 mRNA が検出されましたが、ウェスタンブロットでは GCN1 タンパク質は検出されませんでした。中腸細胞は脂肪体や卵巣ほど多くの栄養素を蓄えておらず、GCN1活性のみを必要とするため、中腸組織は他の代謝的に重要な器官とは異なる方法（転写後制御など）でGCN1タンパク質の発現を制御している可能性があると仮説を立てています。給血周囲の一時的なポイント。今後の研究は、GCN1 mRNA がこの組織内でマイクロ RNA によって隔離されているか、標的にされているかを決定するように設計される必要があります。他の成人女性の組織と比較して、卵巣におけるqRT-PCRおよびウェスタンブロットによって検出されるGCN1発現の増加の観察（図2a）は、GCN1が卵巣の代謝において重要な役割を果たしていることを示しており、これは調査されるべきである。両方の組織は卵黄形成中に重大な代謝変化を受けるため、GCN1 は卵巣と脂肪体の両方で同様の機能を果たしている可能性があります。また、卵母細胞の内因性 GCN1 が胚形成中のアミノ酸代謝を調節する役割を果たしている可能性もあります。最近、GCN1 は、GCN1 変異胚から樹立されたマウス胚細胞における GCN2 非依存的な細胞増殖の調節に関与していることが示唆されています [58]。 AeにおけるAaCAT1-GCN1相互作用が果たす正確な役割を決定するには、特定の組織に対するGCN1ノックダウン効果の直接決定を含む将来の研究を実施する必要がある。ネッタイシマカ卵黄形成。

AaCAT1 の相互作用因子の同定と、それらの細胞シグナル伝達経路への関与は、栄養シグナル伝達経路に関する重要な洞察を提供します。これらの経路に関与するタンパク質を同定することにより、同定されたタンパク質に特異的な化学的標的または阻害剤を設計することができる。 5 つの Ae のうち 1 つだけとのタンパク質相互作用の分析。ネッタイシマカのCATは、AaCAT1と、Aeにおいてこれまで確立されていなかった第2の栄養センサー経路との間の関連性を明らかにした。ネッタイシマカの栄養シグナル伝達。研究すべき CAT 相互作用がさらに増え、GCN1 活性についての理解が広がるにつれて、蚊の栄養センサーシステムの全体像はさらに複雑になるばかりです。

この記事の結論を裏付けるデータセットは、記事 (およびその追加ファイル) 内で入手可能であり、合理的な要求に応じて対応著者から入手できます。

ネッタイシマカカチオン性アミノ酸トランスポーター 1、2、3、5 それぞれ

アミノ酸応答

転写因子4の活性化

CRISPR関連タンパク質9

カチオン性アミノ酸トランスポーター

カチオン性アミノ酸トランスポーター 1、2、4、5 それぞれ

相補的な DNA

クラスター化された規則的に間隔をあけられた短い回文繰り返し

ダブルドロップアウト（メディア）

ジメチルスルホキシド

デオキシリボヌクレオシド三リン酸

二本鎖RNA

ジスクシンイミジルスルホキシド

ジチオスレイトール

エチレンジアミン四酢酸

真核生物の翻訳開始因子 2 サブユニットアルファ

蛍光共鳴エネルギー移動

一般的なアミノ酸管理

一般制御非抑制可能 1、2、4、20 それぞれ

緑色蛍光タンパク質

ヘテロ二量体アミノ酸トランスポーター

オクチルフェノキシポリ(エチレンオキシ)エタノール、分岐鎖

分子進化遺伝学解析

メッセンジャーRNA

ラパマイシンのメカニズムの標的

ラパマイシン複合体1の機構的標的

百万年前

国立バイオテクノロジー情報センター

非逆転写

オリゴマー化デオキシチミジン

リボソームタンパク質 S6 キナーゼベータ-1

採血後の食事

注射後

ポリ二フッ化ビニリデン

クワドラプルドロップアウト（メディア）

定量的逆転写 PCR

受容体を介した貨物の卵巣伝達

RNA干渉

リボソームタンパク質S7

合成定義済みメディア

ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動

溶質キャリアファミリー 7

スリムファスト

トリス酢酸EDTA緩衝液

トリス緩衝生理食塩水

トリス緩衝生理食塩水 + 0.05% Tween-20

ラパマイシンの標的

RNAの転移

ビテロゲニン

卵黄前駆体タンパク質

20-ヒドロキシエクジソン

6-ヒスチジン

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以下の試薬は、NIH/NIAID フィラリア症研究試薬リソースセンターから提供され、BEI Resources、NIAID、NIH を通じて配布されました: ネッタイシマカ、黒目リバプール株、卵、NR-48921。プラスミド 3' EGFP pXOON は、Dmitri Boudko 博士によって提供されました。著者らは、蚊の飼育について協力してくれた Carolyn Armendariz 氏と Hailey Luker 氏、統計分析について協力してくれた Harley Bendzus-Mendoza 氏に感謝します。

この研究は、国立衛生研究所、NMSU博士研究員プログラム、NMSUハワード・ヒューズ医学研究所、ニューメキシコ・アライアンス・フォー・マイノリティ参加者学部研究奨学生プログラムからの助成金#5SC1GM125584および#1R35GM144049によって支援されました。

ニューメキシコ州立大学生物学部、ラスクルーセス、ニューメキシコ州、米国

マシュー・ピンチ、セオドア・ムカ、ヤショーダ・カンデル、マヘシュ・ラムサル、ネイサン・マルティネス、マリアルイサ・テイシェイラ、イモ・A・ハンセン

ReCode Therapeutics、米国テキサス州ダラス

ドミトリ・Y・ブドコ

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MPは、酵母ツーハイブリッドアッセイ、プルダウンアッセイ、qRT-PCR、dsRNA合成、RNAiノックダウン、ウェスタンブロットを実施し、分析データを作成し、図を作成した。 1、2、3、表1、2、3、追加データを用意して原稿を書きました。 TMは、酵母ツーハイブリッドアッセイ、プルダウンアッセイ、dsRNA合成、RNAiノックダウン、分析データ、作成された図を実行しました。１と３を追加データを用意して原稿を書きました。 YK は RNAi ノックダウン、卵巣イメージング、分析データを実行し、図 3 を作成しました。ML はウェスタンブロットと qRT-PCR を実行しました。 NM はウェスタンブロットを実行しました。 MTはqRT-PCRを実施した。 DYB は試薬を提供し、追加の数字を生み出しました。 IAH は実験の構想に貢献し、原稿を執筆しました。著者全員が最終原稿を読んで承認します。

イモ・A・ハンセンへの通信。

適用できない。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

シュプリンガーネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

CAT アノテーションツリーに使用されるすべての CAT エントリのアノテーション。表S2。 AaCAT1 酵母ツーハイブリッドスクリーニングから特定された潜在的なタンパク質相互作用物質。図S1。ああ。ネッタイシマカ AaCAT1 は、細胞膜に局在する膜貫通タンパク質です。ａ． AaCAT1 タンパク質の三次構造は、PyMOL (https://pymol.org/2/) を使用して視覚化されました。 b. TMHMM 膜貫通予測ツール、Krogh et al. [39] を使用して、AaCAT1 の膜貫通ドメイン、細胞内および細胞外領域を予測し、酵母ツーハイブリッド分析用のベイトフラグメントを設計しました。 c. AaCAT1 は、Almagro Armenteros らの DeepLoc-1.0 細胞内局在化ツールによって決定されたように、細胞膜に局在すると予測されています。 [52]。図S2。 GCN1の細胞内局在のインシリコ予測。ａ． GCN1 は細胞質に局在すると予測されていますが、核にも局在する可能性があります。 b. GCN1 で見つかった予測核局在配列 (NLS) により、核と細胞質の混合局在パターンを示すスコアを持ついくつかの NLS が明らかになりました。 c. パート b の結果は、GCN1 アミノ酸配列のコンテキスト内の予測された NLS の位置を示しています。細胞内局在予測は、Almagro Armenteros らの DeepLoc-1.0 細胞内局在化ツールを使用して実行されました。 [52]。 NLS 予測は、Koすぎらの cNLS Mapper 予測ツールを使用して実行されました。 [54]。図S3。 GCN1 のノックダウンは致死的ではなく、YPP の転写には影響を与えません。ａ． GCN1 dsRNA を注射した対照蚊と GFP dsRNA を注射した対照蚊の生存は、注射後 5 日までは有意な差はありませんでした。ログランクマンテル-コックステストを使用して、2 つの治療間の有意差をテストしました。 b. GCN1 dsRNAを注入した対照蚊およびGFP dsRNAを注入した対照蚊におけるvg転写のqRT-PCR分析。各時点で治療ごとに 3 つの生物学的複製を分析し、最初の 24 時間の PBM を通じて vg 発現の倍率変化を計算する前に、vg mRNA レベルをβ-アクチン mRNA に対して正規化しました。対応のある t 検定を使用して、各時点での 2 つの治療間の有意差を検定しました。図S4。ウェスタンブロットとクーマシーブルーの画像は、トリミング、色除去、明るさ/コントラスト補正なしで主要な図に使用されています。各画像の上のラベルには、画像が含まれる本文図への参照が含まれています。

: データセット S1。単一のプレイプラスミドコピーを持つコロニーからのすべての酵母ツーハイブリッドプレイシーケンスを含む Excel ワークブック。各行は単一コロニーからの結果を表し、pGAD-T7 プレイプラスミド内の T7 プロモーターから生成されたプレイインサートの配列を含みます。

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転載と許可

ピンチ、M.、ムカ、T.、カンデル、Y. 他。一般制御非抑制性 1 は、カチオン性アミノ酸トランスポーター 1 と相互作用し、ネッタイシマカの繁殖力に影響を与えます。寄生虫ベクター 15、383 (2022)。 https://doi.org/10.1186/s13071-022-05461-x

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受信日: 2022 年 3 月 23 日

受理日: 2022 年 8 月 27 日

公開日: 2022 年 10 月 21 日

DOI: https://doi.org/10.1186/s13071-022-05461-x

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